氢气和换液频率对体外组织培养法保存关节软骨效果的影响

发布时间：2020-06-04 01:28

【摘要】：目的氢气作为一种理想的抗氧化、抗凋亡物质,可以选择性中和自由基中毒性最强的羟自由基(-OH)和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。而且氢气具有良好的生物膜通透性,可以快速进入细胞及细胞器。对诸多离体器官具有保护作用,如心脏,肺,肾脏等。本研究在组织培养法保存关节软骨方案中加入氢气,探索氢气对关节软骨体外保存效果的影响。再对骨软骨移植物保存期间保存液的换液频率对保存效果的影响进行探索。为进一步探求最佳的骨软骨移植物体外保存方案提供有效的实验依据和指导。方法本实验分为两部分。第一部分氢气对体外组织培养法保存关节软骨效果的影响利用氢气发生装置制备含有不同氢气浓度的保存液。以本地健康猪的膝关节关节软骨为研究对象,无菌条件下用ARTHREX骨软骨移植器械在猪膝关节股骨髁关节面的内外侧负重区钻取圆柱形骨软骨柱120枚,长度为10mm,直径为6mm。随机分为4组:Control组(普通保存液);H-1组(氢气浓度0.2mmol/L);H-2组(氢气浓度0.4mmol/L);H-3组(氢气浓度0.8mmol/L)。4℃条件下隔天换液保存。28天后进行软骨细胞存活率(EB-FDA双荧光染色)、组织学(HE染色、番红O-快绿染色、甲苯胺蓝染色、2型胶原免疫组化染色)、生物力学以及关键蛋白检测(Western Blot),通过分析软骨细胞活性、细胞外基质中蛋白多糖、2型胶原的含量以及特异性蛋白SOD-2、Caspase-3和8-OHdG的表达水平,对含氢保存液的保存效果进行评价。第二部分换液频率对体外组织培养法保存关节软骨效果的影响同样的方法在猪膝关节股骨髁关节面内外侧负重区获取圆柱状骨软骨块60枚,长10mm,直径为6mm。将骨软骨组织随机分为3组:A组(保存期间不换液)20枚;B组(保存期间每7天换液)20枚;C组(保存期间每2天换液)20枚。保存28天后分别进行软骨细胞存活率、组织学(番红O染色)和生物力学性能的检测。通过分析和比较各组软骨细胞存活率,蛋白多糖含量和杨氏模量指标对保存效果进行评价。结果第一部分,(1)细胞存活率:在保存28天时,使用EB-FDA双荧光染色检测各组软骨细胞存活率。结果显示各组细胞存活率均出现明显下降。四组软骨细胞存活率比较发现,H-3组细胞存活率最高,H-3组优于H-2组(P0.05);H-3组和H-2组的细胞存活率明显优于对照组和H-1组(P0.05);对照组和H-1组无明显差异(P0.05)。(2)组织学:HE染色显示各组软骨表面光滑,浅层软骨细胞体积小,多呈单个扁平状;深层软骨细胞体积较大,位于软骨陷窝内,多成簇状密集排列。软骨钙化层细胞较少,骨与软骨连接紧密。番红O染色和甲苯胺蓝染色显示H-3组软骨表面光滑,细胞结构清晰,着色最深,蛋白多糖含量最高。二型胶原免疫组化染色显示H-3组二型胶原含量高于其他各组(P0.05)。(3)生物力学:各组之间杨氏模量没有明显差异(P0.05),生物力学性能没有区别。(4)关键蛋白:Western Blot结果显示SOD-2表达水平H-3组优于H-2组,H-2组优于Control组和H-1组(P0.05),后两者没有明显差异(P0.05)。凋亡因子Caspase-3和DNA损伤后的主要标志物8-OHdG表达H-3组明显低于Control组、H-1组和H-2组(P0.05)。第二部分,(1)细胞存活率:在保存28天时,各组细胞存活率均出现下降。C组软骨组织细胞存活率明显高于A组和B组(P0.05),A组B组细胞存活率较低,两组之间无明显差异(P0.05);(2)组织学:C组软骨组织番红O染色着色最深,蛋白多糖含量高于A组和B组(P0.05),A组和B组软骨组织蛋白多糖含量无明显差异(P0.05);(3)生物力学:C组软骨组织杨氏模量高于A组和B组(P0.05),生物力学性能最好,A组和B组软骨组织无明显差异(P0.05)。结论1、软骨保存液中加入氢气通过抑制氧化应激和细胞凋亡,能够提高关节软骨的体外保存效果,且保存效果与氢气浓度相关。2、每两天换液的保存方案保存关节软骨效果要优于7天换液和不换液的方案。氢气的应用和换液频率的选择为关节软骨体外保存方案的探索提供了新的思路,为软骨组织库的建立提供了新的方案和指导
【图文】：

细胞存活率,保存液,氢气

图 1.细胞存活率检测（ 100 倍）A.软骨组织切片 EB-FDA 双荧光染色；红色代表死细胞，绿色代表活细胞；B.各组细胞存活率比较（**P＜0.01）；H-3 组细胞存活率高于其它组（P＜0.01）；H-2 组细胞存活率高于 H-1 组和 Control 组（P＜0.01）；H-1 组和 Control 组之间细胞存活率没有明显差异（P＞0.05）。Control 组：DMEM 保存液组；H-1：氢气浓度 0.2mmol/L 的DMEM 保存液组；H-2：氢气浓度 0.4mmol/L 的 DMEM 保存液组；H-3：氢气浓度0.8mmol/L 的 DMEM 保存液组。

保存液,细胞存活率,氢气,存活率

图 1.细胞存活率检测（ 100 倍）A.软骨组织切片 EB-FDA 双荧光染色；红色代表死细胞，，绿色代表活细胞；B.各胞存活率比较（**P＜0.01）；H-3 组细胞存活率高于其它组（P＜0.01）；H-2 组存活率高于 H-1 组和 Control 组（P＜0.01）；H-1 组和 Control 组之间细胞存活率明显差异（P＞0.05）。Control 组：DMEM 保存液组；H-1：氢气浓度 0.2mmol/DMEM 保存液组；H-2：氢气浓度 0.4mmol/L 的 DMEM 保存液组；H-3：氢气0.8mmol/L 的 DMEM 保存液组。
【学位授予单位】：泰山医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68

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