吗啡预处理经由ERK通路调控受体相互作用蛋白减轻大鼠全心缺血再灌注损伤的作用机制

发布时间：2020-06-04 02:42

【摘要】：背景全心缺血再灌注损伤常见于体外循环下的心脏及大血管手术、心跳骤停后心肺复苏等,缺血的心肌在循环开放或冠脉血流恢复后,可能会加重心肌损伤,给麻醉和患者生命安全造成严重威胁。已有大量研究表明吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)可显著减轻局部心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI),而MPC是否可减轻全心缺血再灌注导致的心肌损伤,其机制如何,目前尚不明确。心肌细胞死亡是很多心脏疾病的共同特征,主要包括坏死、凋亡以及细胞自噬。事实上,在心肌缺血再灌注过程中,由于坏死而损失的心肌细胞可能远大于凋亡所致的细胞死亡。冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)活性升高也是心肌坏死的重要标志。程序性坏死(necroptosis)是一种全新的细胞死亡方式,这种细胞坏死虽然在形态学上与传统意义上的坏死相似,但与细胞凋亡一样受到体内细胞信号通路的严格调控。最近研究发现,程序性坏死在心肌IRI中发挥重要作用,而且受体相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)是心肌细胞程序性坏死信号中的关键效应分子。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是重要的促生存激酶,再灌注早期激活ERK信号通路可有效促进心肌细胞存活,缩小心肌梗死面积。我们前期研究表明MPC通过激活ERK信号通路减轻心肌IRI,本课题拟在前期研究基础上,探讨ERK信号通路在MPC减轻大鼠全心IRI损伤中的作用,并进一步探究MPC是否通过活化ERK信号通路影响心肌程序性坏死信号通路中的关键分子RIP1和RIP3表达,以期初步阐明吗啡在全心缺血再灌注损伤中发挥心肌保护作用的分子机制。方法雄性SD大鼠,体重250-300 g,随机分为8组(n=10):对照组(CON组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血预处理组(IPC组)、不同浓度吗啡预处理组(MPC0.3,1,3mM三组)、MPC+ERK抑制剂PD98059组(MPD组)、抑制剂PD98059对照组(PD组)。采用Langendorff设备进行离体心脏全心灌注-停灌40 min、再灌注90 min方法制备大鼠全心缺血再灌注损伤(IRI)模型。除CON组心脏持续灌注K-H液外,其余各组心脏均经历全心灌注-停灌40 min、再灌注90 min。IPC组在缺血再灌注前,预先全心停灌5 min,再灌注K-H液5 min,共3个循环;MPC各浓度组在缺血前,预先分别灌注含0.3、1、3mM吗啡的K-H液5 min,再灌注无药K-H液5 min,共3个循环;MPD组于MPC前10 min持续灌注含有PD98059(10mM)的K-H液直至吗啡预处理结束;PD组在相同时间点灌注抑制剂但不进行吗啡预处理或缺血预处理。灌注期间使用注水乳胶球囊置入到大鼠心脏左心室,使用Power Lab生物机能系统测量心脏血流动力学参数包括心率(HR)和左室发展压(LVDP)。分别于各组心脏跳动稳定后收集并测量冠脉流出液,检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,再灌注10 min时取下大鼠心脏提取心肌蛋白,使用Western Blot法检测心肌ERK磷酸化水平及RIP1/3蛋白表达(n=4);再灌注90 min时取下大鼠心脏,通过TTC染色法测量梗死区(IS)、缺血危险区(AAR)体积及IS/AAR比值(n=6)。结果1.成功建立大鼠全心IRI模型CON组于整个实验灌注过程中HR:294~369 bpm,LVDP:90~140 mm Hg;冠脉流出液:11~24 ml/min;而IR组,HR于缺血前:292~364 bpm,再灌注后:200-261 bpm;LVDP于缺血前:117~135 mm Hg,再灌注后:14~22 mm Hg;冠脉流出液于缺血前:13~25 ml/min,再灌注后:5~9 ml/min。两组差异有统计学意义(P0.05),全心缺血时心脏搏动微弱,心肌组织苍白;TTC染色后显示IR组心肌梗死大小明显大于CON组(P0.05)。2.不同浓度MPC对大鼠离体心脏全心IRI的作用在大鼠离体心脏中,0.3mmol/L和1mmol/L的MPC可以显著减轻大鼠离体心脏IRI,缩小心肌梗死面积和再灌注后冠脉流出液中LDH活性,促进再灌注时心功能LVDP的恢复,而浓度大于3mmol/L的MPC反而不能有效减轻心脏的IRI。3.MPC对ERK蛋白磷酸化以及RIP表达的影响MPC(0.3,1mM)促进心肌组织ERK磷酸化,而抑制RIP1和RIP3的表达水平,MPC(3mM)对心肌组织ERK磷酸化以及RIP1和RIP3的水平无显著影响。2.3 PD98059对MPC介导大鼠全心缺血再灌注损伤保护作用的影响在大鼠离体心脏中,MPC和经典IPC均可显著减轻离体心脏全心IR损伤,减小心肌梗死面积,降低冠脉流出液LDH活性,促进再灌注时心功能的恢复。而在MPC前给予ERK抑制剂PD98059后,可阻断MPC的心肌保护作用,提示MPC在大鼠离体心脏中发挥心肌保护作用依赖于ERK通路的活化。2.4 PD98059对MPC诱导大鼠心肌ERK磷酸化以及RIP的影响MPC可以显著升高ERK的磷酸化水平,抑制RIP1和RIP3的表达。PD98059可抑制MPC诱导的ERK磷酸化,逆转RIP1和RIP3的表达水平。结论在SD大鼠中,MPC可通过活化ERK通路蛋白磷酸化,继而可能抑制下游的RIP1和RIP3表达水平,减轻离体心脏全心缺血再灌注损伤损伤。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

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本文编号：2695769