ACVR1介导的BMP信号通路在骨重塑中的作用及机理研究

发布时间：2020-06-04 06:05

【摘要】：研究背景:骨重塑(bone remodeling)在骨的生长以及损伤修复过程中均发挥着至关重要的作用。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)因可诱导异位成骨而被人类发现。目前BMP-2和BMP-7已被批准应用于骨科临床治疗,但其治疗效果并不显著。所以阐明BMPs在体内的作用机制对于提高其临床疗效至关重要。BMP信号通路的激活必须依赖于配体所诱导的异源性四聚体的形成,这种异源性四聚体由I型BMP受体和II型BMP受体组成。其中,I型BMP受体在BMP信号通路的激活过程中起着非常关键的起始作用,活化素I型受体(activin receptor type I,ACVR1)是I型BMP受体之一,当人类ACVR1基因p.R206H位点发生获得性突变时,会引起人类进行性肌肉骨化症(fibrodysplasia ossificans progressiva,FOP),但却不影响患者的内源性骨组织。因此,阐明ACVR1所介导的BMP信号通路在内源性骨组织中的作用及相关分子机制,对调控体内骨稳态及促进骨再生具有非常重要的理论指导意义。目的:体内探究成骨细胞内特异性敲除ACVR1后对小鼠骨重塑的影响;体外探究小鼠前成骨细胞内ACVR1对细胞增殖和分化的影响。材料与方法:体内实验:通过Cre-loxP系统建立成骨细胞内特异性敲除Acvr1基因的小鼠动物模型,在出生后21天时脱颈处死。利用TRIzol试剂提取小鼠右股骨组织内总mRNA,实时定量RT-PCR检测相关基因的表达;利用micro-CT测量小鼠左股骨骨量的变化;小鼠左股骨经脱钙、脱水以及石蜡包埋后,进行组织学切片,之后利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、静态组织形态测量学等方法进一步检测小鼠股骨在形态学上的变化。体外实验:体外分离并培养c57乳鼠的颅骨前成骨细胞,通过lipofectamine载siRNA的方法转染和沉默细胞内Acvr1基因的表达,利用流式细胞术检测转染效率,实时定量RT-PCR检测细胞内Acvr1基因的沉默效率,应用MTT检测Acvr1基因沉默后细胞增殖能力的改变,茜素红染色检测Acvr1基因沉默后细胞矿化能力的改变。结果:体内实验:选用Osx-Cre;Acvr1~(fx/-)基因型的雄鼠作为实验组,以同窝出生的Osx-Cre;Acvr1~(fx/+)基因型的雄鼠作为对照组。Micro-CT结果表明出生后21天的Acvr1 cKO小鼠股骨骨量无明显变化,但密质骨组织矿物质密度和骨矿物质密度均明显下降,股骨远端松质骨骨小梁数目增多;静态组织形态测量学分析结果表明,Acvr1 cKO小鼠股骨远端生长板下方骨松质区域与对照组相比,骨量无明显变化,骨小梁数目增大,骨小梁分离度减小,骨小梁厚度则无改变,骨表面成骨细胞数量和成骨细胞表面增大,而破骨细胞数量和破骨细胞表面则无明显变化;实时定量RT-PCR结果表明实验组小鼠成骨分化相关基因(Col1、Opn)的表达明显增多,破骨分化相关基因(Mmp9、Ctsk、Tracp)表达无明显差异,Wnt信号通路抑制剂(Dkk1、Sost)表达显著升高。体外实验:流式细胞术和实时定量RT-PCR检测结果表明lipofectamine-siRNA复合体可以成功转染并有效沉默小鼠前成骨细胞内Acvr1基因的表达;MTT结果表明小鼠前成骨细胞内Acvr1基因沉默后可以促进细胞的增殖能力;茜素红染色结果表明小鼠前成骨细胞Acvr1基因沉默后可以降低细胞的矿化水平。结论:在体内:成骨细胞内ACVR1在小鼠断奶前对骨量的调控作用不明显,但对骨的矿化起正性调控作用;在体外:成骨细胞内ACVR1能够抑制小鼠前成骨细胞的增殖,而促进小鼠前成骨细胞的成骨向分化。
【图文】：

图 2.1 雄鼠（3 周龄）股骨骨量无明显变化。（A）Micro-CT 三维重建图片。（B-E）密质骨参数；（F-K）松质骨参数。对照组（Cont）n=5；实验组（cKO）n=5。*：p < 0.05。为了检测小鼠股骨的组织学变化，我们对股骨远端生长板下方松质骨进行了静态组织形态测量学分析。分析结果表明：与对照组相比， Acvr1 cKO 组骨量无明显变化（图 2.2 B），但 Acvr1 cKO 组的 Tb. N 增多（图 2.2 C）、且 Tb. Sp减小（图 2.2 E）；与对照组相比， Acvr1 cKO 组 N. Ob/BS 和 Ob. S/BS 均明显增多（图 2.2 F、G），但 N. Oc/BS 和 Oc. S/BS 在两组小鼠中均无统计学改变（图 2.2 H、I）。

图 2.2 雄鼠（3 周龄）股骨远端组织形态测量学分析。（A）H&E 染色和 TRAP染色结果，，图中显示测量区域。（B-I）静态组织形态测量学参数。对照组（Cont）n=5；实验组（cKO）n=5。*：p < 0.05；**: p < 0.01。2.3.2 成骨细胞内特异性敲除 Acvr1 后导致成骨分化、破骨分化相关基因改变为了检测成骨细胞内特异性敲除 Acvr1 基因后，成骨分化和破骨分化标志基因的改变，我们提取小鼠股骨总 mRNA，逆转录为 cDNA 后，实时定量RT-PCR 分别检测成骨分化标志基因（Runx2、Osx、Col1、Alp、Ocn、Opn）和破骨分化标志基因（Mmp9、Ctsk、Tracp），实验结果表明仅成骨标志基因 Col1（p<0.05）和 Opn（p<0.01）表达明显升高。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68

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本文编号：2695991