组蛋白甲基转移酶EZH2抑制主动脉平滑肌细胞自噬性死亡的作用及机制研究

发布时间：2020-06-07 06:52

【摘要】：目的:主动脉夹层(Aortic dissection,AD)是一种心血管急危重症,具有起病急、死亡率高、并发症多的特点,严重威胁人类健康。主动脉中膜血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscles cells,VSMCs)的异常减少是主动脉夹层形成的主要病理基础之一。因此,阐明VSMCs异常减少的发生机制将有助于降低AD的发生率和死亡率以及改善预后。最新研究发现,VSMCs自噬增强与VSMCs数量减少密切相关,该过程可能在AD的发生发展过程中发挥重要作用。细胞自噬是受多种机制调控的一种生物学过程,有证据显示蛋白质的甲基化修饰与细胞自噬密切相关。Zeste基因增强子同源物2(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是一种组蛋白甲基转移酶,目前研究证实其能调节组蛋白H3第27位赖氨酸二甲基化、三甲基化(H3K27me2,H3K27me3)状态介导基因沉默,参与调控细胞增殖、迁移、凋亡等过程,但是EZH2是否能调控VSMCs自噬及其与AD发生发展的关系尚无相关研究报道。本课题旨在研究EZH2在主动脉夹层疾病中的作用及具体机制。方法:1.组织标本的收集、处理:主动脉夹层样本取自16例Stanford A型主动脉夹层(Type A aortic dissection,TAAD)病人的主动脉壁,正常对照组样本取自无主动脉疾病的心脏移植病人的主动脉壁。主动脉壁样本经石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红染色(HE染色)、弹性纤维染色(EVG染色),显微镜下观察组织标本组织学变化。通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测组织标本中自噬标志分子LC3I/II蛋白表达水平,荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time PCR)实验检测EZH2的mRNA的表达水平。2.构建EZH2功能缺失或功能增强的主动脉血管平滑肌细胞(MOVAS细胞)。EZH2功能缺失的MOVAS细胞:采用5μM特异性EZH2抑制剂UNC1999处理MOVAS细胞或用慢病毒包装携带EZH2短发夹RNA(sh EZH2)的p Sico R质粒感染MOVAS细胞,抑制或敲低EZH2。EZH2功能增强的MOVAS细胞:用慢病毒包装携带目的基因EZH2的p Sico R质粒感染MOVAS细胞,在MOVAS细胞中过表达EZH2。显微镜下观察细胞,并在不同时间点(处理前、处理后6小时、12小时、24小时、36小时、48小时)分别进行细胞计数,探明EZH2功能缺失或功能增强对主动脉平滑肌细胞的影响。3.检测EZH2功能缺失或功能增强的MOVAS细胞的增殖、凋亡及自噬水平的变化,分析MOVAS细胞减少的原因:A.细胞增殖的检测:采用Western blot实验和免疫荧光实验对细胞增殖标志分子PCNA和Ki67的表达进行检测,PI染色流式细胞计数检测细胞周期,观察EZH2对细胞增殖的影响;B.凋亡的检测:利用Annexin V-PE/7-AAD标记凋亡细胞,采用流式细胞技术进行细胞分选,记录对照组、UNC1999抑制组、敲低EZH2组和过表达EZH2组凋亡细胞比例;C.自噬的检测:电镜下观察EZH2功能缺失或增强的MOVAS细胞内自噬体和自噬溶酶体形成的情况;采用Western blot实验检测自噬标志分子LC3I/II表达水平。4.检测EZH2影响自噬及细胞存活的具体方式:A.采用Western blot实验检测自噬体形成调节分子ATG5和ATG7的蛋白表达水平;B.慢病毒包裹m Cherry-GFP-LC3质粒感染MOVAS细胞,双荧光标记LC3,倒置荧光显微镜下观察并计数,监测自噬流的变化;C.用CQ或CQ+Rapamycin分别处理EZH2功能缺失或增强的MOVAS细胞,检测自噬水平的变化;D.用慢病毒包装携带ATG5或ATG7短发夹RNA(sh ATG5或sh AT7)的p Sico R质粒感染EZH2功能缺失或增强的MOVAS细胞,检测自噬和细胞数量的变化。5.探索EZH2发挥自噬调控作用的具体信号通路:采用Western blot实验检测AMPKα、m TOR、Akt和MEK-ERK1/2信号通路内关键分子的表达情况,分析EZH2对相关信号通路活化的影响;用50μM MEK1抑制剂PD98059处理EZH2功能缺失的MOVAS细胞,Western blot实验检测自噬标志分子LC3I/II的表达,并进行细胞计数,验证MEK-ERK1/2信号通路在EZH2调控细胞自噬过程中的作用。结果:1.与正常主动脉壁标本相比,Stanford A型主动脉夹层主动脉壁组织中LC3II蛋白表达增强,EZH2的m RNA表达明显减少。2.抑制或敲低EZH2后MOVAS细胞数量显著减少,细胞自噬水平明显增强,而细胞增殖或细胞凋亡水平没有变化;抑制或敲低EZH2的MOVAS细胞中调控自噬体形成的关键分子ATG5和ATG7表达升高,电镜下观察自噬体数量增多。相反,过表达EZH2的MOVAS细胞数量增加,细胞自噬水平明显减弱,而细胞增殖或细胞凋亡水平没有变化;过表达EZH2的MOVAS细胞中调控自噬体形成的关键分子ATG5和ATG7表达降低,电镜下观察自噬体数量减少。进一步的研究显示,敲低ATG5或ATG7能逆转抑制或敲低EZH2导致的自噬增强和细胞数量减少。以上结果说明,EZH2通过调节自噬相关蛋白ATG5和ATG7的表达抑制自噬小体的形成,减弱细胞自噬,减少VSMCs自噬性死亡(Autophagic cell death,ACD)的发生。3.不论抑制或敲低EZH2还是过表达EZH2,AMPKα、m TOR信号通路活化均未受到影响。抑制EZH2的MOVAS细胞中Akt蛋白磷酸化水平相应降低,但是过表达Akt并不能逆转抑制EZH2导致的自噬增强和细胞减少。另一方面,抑制或敲低EZH2能够增强MEK-ERK1/2信号通路的活化,而过表达EZH2则抑制MEK-ERK1/2信号通路的活化;抑制MEK-ERK1/2信号通路能够逆转抑制或敲低EZH2导致的细胞自噬增强和细胞数量减少。以上结果提示,MEK-ERK1/2信号通路介导了EZH2调控VSMCs自噬性死亡的过程。结论:EZH2通过抑制ATG5和ATG7的表达阻遏自噬小体的形成,从而降低主动脉平滑肌细胞自噬水平,减少细胞自噬性死亡,防止主动脉壁血管平滑肌细胞异常减少,同时,MEK-ERK1/2信号通路也参与了EZH2调控血管平滑肌细胞自噬的过程。因此,EZH2有望成为临床预防、诊断以及治疗主动脉夹层的新靶点,并为开发治疗主动脉夹层药物提供了理论依据。
【图文】：

主动脉壁,心脏移植,主动脉疾病,实时荧光定量PCR

定量 PCR 检测主动脉壁组织中 EZH2 的 mRNA 水平，心脏移植病人的主动脉壁组织；TAAD：Stanford A 型主制 EZH2 活性对 MOVAS 细胞的影响究 EZH2 表达变化是否参与了主动脉平滑肌细制剂 UNC1999 处理小鼠主动脉平滑肌细胞，，研药物浓度（0μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μ MOVAS 细胞 48 小时后提取细胞蛋白，通过 W1999 处理 MOVAS 细胞后细胞中 H3K27me2 和99 抑制 EZH2 的最佳浓度（图 1-3A）。结果显示27me2 和 H3K27me3 水平降低最为显著。我们

浓度梯度,给药,细胞,乳酸脱氢酶

图 1-3 （A）经 UNC1999 浓度梯度给药处理 MOVAS 细胞 48 小时后，Western blot 检测H3K27me2、H3K27me3 的蛋白表达水平；（B）按 UNC1999 浓度梯度给药处理 MOVAS 细胞48 小时后，乳酸脱氢酶检测法检测细胞损伤比例。*p<0.05 vs. DMSO。我们采用 5μM UNC1999 处理细胞后的不同时间点（0h、12h、24h、36h、48h）于
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R654.3

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