全基因组外显子测序筛查青少年特发性脊柱侧凸可疑致病基因ADAMTS9

发布时间：2020-06-11 07:36

【摘要】：目的利用全基因组外显子测序技术筛查家系AIS的致病基因,并在其它家系AIS及散发AIS人群中靶向测序验证,比较AIS病例组与正常对照组致病基因表达水平的差异,初步探索其可能的致病机制。方法1)收集南华大学附属第一医院脊柱外科在2016年6月至2018年1月收治住院或复查的AIS病人及因外伤收治入院而无其它已知骨科疾病的病人的外周血DNA,收集AIS家系成员及正常对照的外周血淋巴细胞;2)采用全基因组外显子测序技术筛查家系I中的AIS致病基因,测序对象为Ⅲ:5(正常),Ⅲ:6(AIS患者)及Ⅲ:7(AIS患者),结合相关研究报道的致病基因筛选方法,筛选Ⅲ:6及Ⅲ:7中共有的突变,并从中剔除掉与Ⅲ:5相同的突变,对剩余的候选致病基因进行家系共分离,对最终筛选出来的致病基因进行软件信息学的预测分析及物种保守性分析;采用靶向测序技术筛查家系II中的AIS患者及散发AIS患者的致病基因;3)采用EB病毒转染人外周血B淋巴细胞,使之成为永生化的B淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR评价致病基因在AIS病例组与正常对照组之间表达水平的差异。结果在复合杂合遗传模式下,Ⅲ:6及Ⅲ:7(除去Ⅲ:5)共有3个基因7个位点的突变,但这些变异位点均未能实现复合杂合遗传模式下的家系I成员的疾病共分离,因此予以剔除;在纯合遗传模式下,Ⅲ:6及Ⅲ:7(除去Ⅲ:5)有12个共有的突变基因,通过家系共分离成功筛查到致病基因突变位点:ADAMTS9 c.625CT(纯合),且软件信息学预测提示该位点突变有害,物种保守性分析提示该位点高度保守;靶向测序家系II中AIS成员中的ADAMTS9基因,成功筛查到复合杂合突变ADAMTS9 c.625CT(杂合)+ADAMTS9 c.4811GA(杂合),并实现了复合杂合模式下家系II成员的疾病共分离;在35例散发病人中发现一例AIS病人C5存在ADAMTS9的复合杂合突变ADAMTS9 c.625CT+ADAMTS9 c.4811GA,94例正常对照中没有发现ADAMTS9 c.625CT(纯合)及ADAMTS9 c.4811GA(杂合),但在1例正常对照中发现了ADAMTS9 c.625CT(杂合),经统计学分析,我们发现AIS组ADAMTS9的验证率显著高于正常对照组(p0.05),sanger测序未筛查到POC5、AKAP2及MAPK7的突变,RT-PCR结果显示两例家系中的AIS成员的ADAMTS9的表达水平均高于正常对照,差异具有统计学意义(p0.01)。结论1.ADAMTS9基因是AIS的可疑致病基因;2.ADAMTS9基因的过表达可能参与AIS的致病机制。
【图文】：

患者,脊柱侧凸,特发性脊柱侧凸

脊柱侧凸是一种三维脊柱畸形，这种三维畸形表现为一段或多段脊柱侧向弯曲并伴有椎体旋转。在影像学上，使用 Cobb's 方法测量脊柱的侧向弯曲，如果Cobb’s 角度大于 10°即可定义为脊柱侧凸（图 1d），Cobb's 角度较小的脊柱侧凸在外表上往往没有明显的阳性体征，严重的脊柱侧凸可表现为外观畸形（图 1a），双肩失衡及剃刀背畸形（图 1b），甚至伴有心肺功能障碍的体征表现。根据病因可分为特发性脊柱侧凸，先天性脊柱侧凸，神经肌肉型脊柱侧凸，神经纤维瘤病合并脊柱侧凸，间充质病变合并脊柱侧凸，骨软骨营养不良合并脊柱侧凸及代谢性障碍合并脊柱侧凸等[1]。其中特发性脊柱侧凸是以上几种侧凸种类中最为常见的，特发性脊柱侧凸的诊断除满足侧凸的基本要求外，还需满足影像学上无脊柱结构畸形（图 1c），并排除掉其他可能的致病病因，根据发病年龄的不同，又可细分为幼儿型脊柱侧凸，少儿型脊柱侧凸及青少年特发性脊柱侧凸，，其中青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）的发病率最高[2]。

谱图,家系,谱图,脊柱侧凸

2 实验材料与方法2.1 研究对象2.1.1 全基因组外显子测序研究对象2.1.1.1 研究家系一般情况在湖南省衡阳县收集了一个 AIS 家系（家系 I），家系中的两名 AIS 患者经过脊柱外科医生的确诊，符合该病的诊断标准。详细资料如下：先证者家族 3 代共 20 人，我们共采集到 14 例，其中男 7 例，女 7 例，患者2 例（图 2）。先证者 III:6，女，17 岁，14 岁发现脊柱侧凸，于脊柱外科行矫形手术治疗（图 3）；患者 III:7，男，14 岁，14 岁诊断为 AIS，于脊柱外科行手术治疗（图 4）；余家系成员经详细的病史询问及体格检查，对于怀疑侧弯者，行胸腰椎正侧位 X 片检查，均无脊柱侧凸。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R726.8

【参考文献】