机械应力通过初级纤毛和自噬的交互作用调控软骨发育的机制研究

发布时间：2020-06-11 08:24

【摘要】：目的:1、探索不同强度的机械应力刺激对大鼠软骨细胞增殖能力、细胞活性和软骨表型等的影响。2、探究初级纤毛和自噬在软骨细胞发育过程中的定位表达和调控关系。3、探究机械应力刺激对初级纤毛和自噬交互作用的影响及ERK-m TOR信号轴在此调控过程中的作用。4、探讨多磷酸肌醇5磷酸酶E(INPP5E)在应力介导的初级纤毛和自噬交互调控中的作用。方法:1、体外分离培养新生大鼠的关节软骨细胞,通过四点弯曲应力系统对软骨细胞施加不同强度(1000μstrain、2500μstrain、4000μstrain;1Hz;2h)的周期性应力刺激,通过Western blot实验检测增殖相关蛋白Cyclin D1、PCNA和表型相关蛋白COL II表达;RT-PCR检测表型相关基因COL II和SOX9表达;Live/dead检测细胞活性变化情况。2、通过透射电镜、免疫荧光双标染色等观察初级纤毛和自噬在软骨细胞发育过程中的定位表达情况;分别使用无血清培养基诱导纤毛,水合氯醛破坏纤毛,雷帕霉素(Rapamycin)以及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)分别激活和抑制自噬,再以免疫荧光双标染色和Western blot等实验探究初级纤毛和自噬的表达关联性及相关蛋白功能的调控关系。3、通过四点弯曲应力系统给予软骨细胞不同强度的应力刺激(1000μstrain、2500μstrain、4000μstrain),免疫荧光染色和Western blot等实验分别检测软骨细胞初级纤毛发生率、长度及功能蛋白IFT88的表达,以及软骨细胞自噬水平及自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达。用水合氯醛破坏纤毛结构后,再通过Western blot实验检测2500μstrain的应力刺激对初级纤毛和自噬相关蛋白交互调控的影响,并检测ERK-m TOR信号轴相关P-ERK、P-m TOR蛋白的表达情况。4、体外给予软骨细胞不同强度的应力刺激,Western blot检测INPP5E蛋白的表达情况;再通过构建并转染INPP5E的小分子干扰RNA,RT-PCR、Western blot验证其转染效率,免疫荧光染色检测初级纤毛和自噬的表达情况;再在转染INPP5E si RNA后给予2500μstrain的应力刺激,检测下调INPP5E后应力刺激对IFT88、LC3、Cyclin D1、COL II蛋白表达的影响,同时动物实验验证运动训练对骨关节炎软骨基质分泌和IFT88、LC3B、INPP5E蛋白表达的影响。结果:1、中低强度的应力刺激(1000和2500μstrain)能上调Cyclin D1、PCNA的表达,而高强度应力刺激(4000μstrain)则作用不明显;中低强度的应力刺激对软骨细胞的活性没有明显影响,而高强度应力刺激后凋亡的软骨细胞数量增多。同样的,中低强度的应力刺激上调表型相关基因COL II、SOX9和COL II蛋白的表达,而高强度刺激则呈抑制效应。2、正常软骨细胞中存在初级纤毛和自噬的共表达,并且二者在软骨细胞周期中存在一定的定位表达关系,无血清饥饿可同时诱导初级纤毛、自噬及其蛋白的表达,水合氯醛抑制纤毛的同时下调自噬及其蛋白表达,雷帕霉素在激活自噬的同时上调IFT88蛋白的表达,而3-甲基腺嘌呤抑制自噬的同时减少初级纤毛的发生率和长度。3、高强度应力刺激(4000μstrain)下调初级纤毛的发生率和长度,中低强度的应力刺激(1000μstrain和2500μstrain)上调IFT88蛋白表达但对纤毛表达率和长度无明显影响。应力刺激促进软骨细胞自噬表达,且呈强度依赖性,2500μstrain时达到峰值,高强度刺激呈抑制效应。2500μstrain应力刺激在促IFT88、LC3、Beclin1表达的同时能上调P-ERK并下调P-m TOR;水合氯醛破坏纤毛结构后能下调IFT88、LC3、Beclin1和P-ERK蛋白表达,上调P-m TOR;同时水合氯醛还能抑制2500μstrain应力刺激对IFT88、LC3、Beclin1和P-ERK的促表达效应并上调P-m TOR表达。4、应力刺激能促进软骨细胞INPP5E蛋白的表达,在中低强度(1000μstrain和2500μstrain)时最明显。si RNA下调INPP5E后,软骨细胞内初级纤毛和自噬的表达水平同时降低。与对照组相比,2500μstrain的应力刺激能促进IFT88、LC3-II、Cyclin D1、COL II的表达,但同时沉默INPP5E后IFT88、LC3-II、Cyclin D1、COL II的表达均降低。基于力学刺激的适度运动训练有利于骨关节炎软骨的基质分泌,同时上调软骨组织中IFT88、LC3B和INPP5E的表达。结论:1、适当强度的应力刺激能促进软骨细胞的增殖和表型维持,而高强度应力刺激会影响软骨细胞活性。2、初级纤毛和自噬在软骨发育过程中存在一定的定位表达关联性,二者存在交互调控作用。3、应力刺激能影响软骨细胞初级纤毛和自噬的表达,应力刺激可以通过初级纤毛-ERK-m TOR信号轴转导力学信号调控软骨细胞自噬的表达。4、应力刺激能促进软骨INPP5E的表达,其能参与应力刺激对初级纤毛和自噬交互作用的表达调控,可能是应力刺激介导初级纤毛和自噬交互调控作用的关键位点。
【图文】：

应力刺激,相关蛋白,凋亡细胞,强度范围

干预后凋亡细胞数量增多，活细胞的比例有所下降，并且结果具有统计学差异（如图3 所示），说明适当强度范围内的机械应力刺激并不影响软骨细胞的活性，而当应力强度增加到一定程度之后，凋亡细胞的比例会增加，应力刺激对软骨增殖能力和细胞活性的影响均呈现一定的强度依赖性。

软骨细胞,放大倍数,红色,应力刺激

不同强度的周期性应力刺激对软骨细胞活性的影响（红色代表凋亡细胞，，绿色代表活细胞，放大倍数×100）
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684.3

【参考文献】