“铁蓄积”影响骨代谢的临床观察及分子机制

发布时间：2020-06-13 08:05

【摘要】：第一部分绝经后脆性骨折患者“铁代谢”与“骨代谢”指标的临床相关性观察目的:观察绝经后髋部脆性骨折患者血清铁蛋白、骨铁含量与骨密度(髋部、腰椎)、骨转换指标的临床相关性。方法:回顾性分析2014年01月至2017年05月,因髋部脆性骨折(股骨颈骨折)入我院行髋关节置换术的304例绝经后女性患者临床指标,所有患者均知情同意。手术过程中收集股骨头标本进行骨铁含量检测。所有患者术前1天收集血清并检测相关指标,术后7天健侧髋部及腰椎检测骨密度。排除标准:(1)多发骨折(n=6);(2)慢性肝脏疾病(n=2);(3)糖尿病及甲状腺相关疾病(n=31);(4)术后感染(n=4);(5)双膦酸盐应用史(n=1)。最终纳入260例患者,相关临床资料行统计学分析。结果:血清铁代谢(铁蛋白Fer、骨铁Bone iron、转铁蛋白TRF、血清铁离子Fe)指标绘制矩阵图,其中铁蛋白与骨铁两两相关性最强,呈显著正相关。单因素Pearson相关分析观察所有临床指标与骨铁相关性,仅铁蛋白呈正相关(r=0.696,p=0.000)。Pearson相关分析观察临床指标与髋部及腰椎骨密度(BMD)相关性,其中,年龄、Fer、骨铁、BMI、TRF与BMD存在显著相关性,其中年龄、Fer、骨铁、BMI能纳入髋部BMD多元线性回归方程,年龄、Fer、骨铁能纳入腰椎BMD多元线性回归方程。控制年龄、Fer及BMI,对骨铁行骨密度偏相关分析,结果显示骨铁与髋部及腰椎BMD均存在明显负相关性。对年龄、骨铁及骨密度三者绘制三维散点及mesh图,以等值线图作为结果表示:随着骨铁水平和年龄的上升,髋部及腰椎骨密度明显减少。根据WHO关于骨质疏松症(OP)的诊断标准,把260例骨折患者分为两组:骨质疏松组与非骨松组,将OP的诊断作为因变量,骨铁作为自变量绘制受试者工作特征曲线(ROC),曲线下面积AUC=0.790(p0.05),截断点骨铁为139.7μg/g。以骨铁139.7μg/g作为界值将该部分人群分为高骨铁组与低骨铁组,比值比OR=12.143(95%CI=5.406—27.777),高骨铁患者的骨质疏松发病风险为低骨铁患者的12.143倍。Peason相关分析观察骨铁与骨转换指标(BTMs)相关性,结果提示骨铁与骨吸收指标(TRAP-5b、β-CTX)存在明显正相关(r=0.202,0.209;p=0.012,0.009)。结论:骨铁指标与血清铁蛋白有相关性,在对骨折创伤患者铁代谢水平的诊断中具有一定价值。女性骨量下降的独立危险因素可能包括高浓度的骨铁。骨铁含量的升高影响骨量的现象可能涉及骨吸收的过程。第二部分铁蓄积对小鼠骨质疏松模型中骨代谢、成骨细胞及破骨细胞活性的影响目的:研究铁剂干预后,正常小鼠与卵巢切除骨质疏松模型小鼠骨量、骨转换指标、成骨及破骨细胞相关功能的改变。方法:对第一部分临床结论进行基础实验的初步模拟。1、动物实验:3月龄ICR雌性小鼠随机分为4组(con组、OVX组、F组、F+OVX组),前两组注射NS,余两组注射等量枸橼酸铁胺(FAC),con及F组为假手术组,余组切除双侧卵巢。4周后检测小鼠体重。肝脏、骨组织行普鲁士蓝铁染色,股骨Micro-CT进行三维扫描。血清Fer、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(osteocalcin)、Ⅰ型胶原C端肽(CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)采用酶联免疫吸附法(ELISA)观察。小鼠冲出骨髓,细胞悬液添加巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)及核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导破骨细胞,TRAP染色计数阳性细胞。2、细胞实验:(1)New-born小鼠分离颅骨,胰酶梯度消化抽提原代成骨细胞,分为对照组、E2组、FAC组、FAC+E2组,其中FAC浓度为10μM,雌二醇浓度为10n M,3天行ALP染色,14天行茜素红钙结节染色。荧光定量PCR(q-PCR)观察成骨相关基因(RUNX2、SP7、BGLAP)表达。(2)RAW264.7分组同上,添加RANKL向破骨细胞分化诱导,分化程度采用TRAP染色分析,镜下观察DCFH-DA干预后成骨及破骨细胞活性氧(ROS)荧光强度。破骨相关基因(TRAP5、CTSK、MMP9、CALCR)表达采用q-PCR分析。结果:1、在体研究:各组小鼠体重无统计学差异(p0.05)。干预结束后F组、F+OVX组血清Fer水平显著上升(p0.05),肝脏及股骨远端普鲁士蓝铁沉积显著。Micro-CT结果显示:雌激素水平正常,铁蓄积不能影响骨密度;当卵巢切除后,铁蓄积组骨量下降更为显著。血清蛋白ELISA结果表明:正常雌激素水平小鼠(F组)相较于对照组,骨吸收指标(TRAP-5b、CTX)及氧化应激指标(MDA、SOD)无明显统计学差异,组间TRAP染色原代破骨细胞计数无显著差异,F组骨形成指标(ALP、osteocalcin)较对照组下降;雌激素缺乏后,铁蓄积能显著上升MDA及骨吸收指标水平,并下调骨形成指标及SOD,且破骨细胞数显著高于卵巢切除组(p0.05)。2、离体研究:(1)成骨细胞,ALP活性、成骨相关基因表达均被铁剂抑制。(2)RAW264.7细胞TRAP染色结果示:铁剂干预后破骨样细胞数明显增加,在雌激素预干预时,E2组与FAC+E2组TRAP阳性细胞数无明显差异。DCFH-DA检测结果:铁剂能显著上调成骨及破骨细胞胞内ROS水平(p0.05)。q-PCR结果:FAC显著增加TRAP-5、CTSK、MMP9、CALCR表达水平,雌激素预干预后,该上调作用被抑制。结论:雌激素水平正常时,铁蓄积对骨代谢无明显影响。雌激素缺乏时,铁蓄积促进骨量下降,该过程与骨吸收、破骨活性上调相关,ROS水平可能调控该过程。第三部分骨质疏松模型小鼠铁剂干预后不同时间骨代谢相关指标的变化目的:观察铁剂干预的不同时间点,骨质疏松模型小鼠骨量、骨转换指标、成骨及破骨细胞相关功能的改变。方法:根据第二部分结论,随机将12周龄的雌性ICR小鼠分为E+F-组、E-F-组、E-F+组,E-F-组、E-F+组均行双侧卵巢切除术。E+F-组及E-F-组注射NS,余组注射等量FAC,干预4周,各组每周处死6只小鼠,收集所有小鼠血清进行细胞实验。检测小鼠体重。股骨远端行Micro-CT三维重建。ELISA检测血清Fer、ALP、osteocalcin、CTX、TRAP-5b、MDA及SOD。提取所有小鼠股骨及胫骨中骨髓基质细胞进行破骨细胞诱导,TRAP染色观察破骨细胞分化并计数。提取新生小鼠原代成骨细胞,以收集的小鼠血清进行培养,根据培养所用的小鼠血清分为相应的三组,3天行ALP染色,14天行茜素红染色。结果:FAC干预一周血清Fer即有统计学差异(p0.05)。在FAC干预过程中,血清骨形成相关指标ALP、osteocalcin于最后一周出现统计学差异(p0.05)。TRAP-5b、CTX分别于第3周、第2周出现统计学差异(p0.05)。SOD在FAC干预第2周时下降(p0.05),MDA在第1周时上调(p0.05)。Micro-CT结果显示:BMD于第4周出现统计学差异(p0.05);三维重建及其余参数均符合该结果。TRAP染色示:铁剂干预第2周破骨细胞分化增强,第4周达到峰值。ALP染色示:FAC干预第2周明显抑制成骨细胞活性。钙结节染色提示:第3周钙结节矿化受明显抑制。结论:铁蓄积首先影响活性氧水平(1-2周),继而影响破骨细胞分化(2周)及骨吸收(2-3周),再影响成骨细胞矿化(3周)及骨形成(4周),最终影响骨量(4周)。各组所有指标均于第4周出现最大差异。第四部分MAPK及NF-κB信号通路在“铁蓄积增强破骨细胞活性”中的作用目的:观察高铁环境下,MAPK及NF-κB信号通路相关指标在骨组织及破骨细胞中的改变,并探讨氧化应激在其中的作用。方法:收集第三部分实验中,所有第4周的标本。骨组织切片行HE染色及破骨细胞TRAP染色。骨组织提取RNA及蛋白,检测成骨、破骨相关基因及蛋白表达,同时检测氧化应激蛋白(GSH-Px)水平。提取并诱导原代破骨细胞,TRAP染色计数阳性细胞数,DCFH-DA检测胞内ROS水平。骨组织蛋白检测MAPK(ERK1/2、p38、JNK及相应磷酸化蛋白)及NF-κB(胞核P50、P65及胞浆IκBα)信号通路蛋白。取E-F-组、E-F+组原代破骨细胞,在E-F+组基础上干预MAPK通路抑制剂和NF-κB通路抑制剂,并检测对应蛋白表达及破骨细胞分化情况。凝胶电泳迁移率实验(EMSA)分析二聚体蛋白和DNA的结合程度。对E-F-组细胞进行H2O2干预,并以BAY11-7082抑制NF-κB通路,检测三组细胞NF-κB通路相关蛋白表达、破骨细胞分化、蚀骨能力及DNA与NF-κB结合能力。对E-F-组、E-F+组小鼠干预狄诺塞麦(Damb),Micro-CT三维重建,提取并诱导原代破骨细胞,TRAP染色计数,Western blot检测骨组织RANKL蛋白表达。结果:q-PCR结果提示:第4周铁蓄积显著上调破骨相关基因表达(p0.05)。破骨相关蛋白TRAP及Cathepsin K表达水平在高铁环境中也显著上升(p0.05)。而FAC对成骨相关基因和蛋白表达无明显影响。铁蓄积明显下调骨组织中GSH-Px表达。HE染色表明:卵巢切除后骨小梁明显稀疏,FAC干预后骨小梁间隙进一步增大。骨组织及原代破骨细胞TRAP染色提示:铁剂干预后,骨组织破骨细胞数明显增加。DCFH-DA荧光提示:铁剂干预明显增强破骨细胞胞内ROS荧光数量及强度。骨组织Western blot结果:MAPK信号通路相关蛋白检测结果表明,ERK及JNK信号通路被FAC明显激活,而p38信号通路在高铁环境下无明显改变(p0.05)。NF-κB信号通路相关蛋白检测结果表明,FAC显著激活核内P65/P50二聚体表达。对高铁环境下原代破骨细胞进行MAPK通路抑制,破骨细胞分化无明显差异,q-PCR结果与TRAP染色结果一致。对高铁环境下原代破骨细胞进行NF-κB通路抑制,破骨细胞TRAP阳性细胞数明显下降(p0.05)。EMSA结果示:NF-κB与DNA结合能力下降。H2O2干预后,破骨细胞GSH-Px表达下降,IKKα表达上升,破骨细胞分化能力增强,NF-κB通路抑制后,IKKα表达水平下降,破骨细胞分化能力及蚀骨活性减弱。E-F-组、E-F+组Damb干预后,相较于E-F-组、E-F+组,骨量恢复明显,破骨细胞分化明显抑制,组内比较无统计学差异。结论:铁蓄积对破骨细胞的分化增强作用与ROS上调,并进一步激活NF-κB信号通路有关,与MAPK信号通路无关。IKKs蛋白可能是铁影响骨吸收的上游靶点。
【图文】：

矩阵图,矩阵图,骨代谢,分子机制

铁代谢指标（Fer、Boneiron、TRF、Fe）矩阵图

髋部,腰椎,年龄,转铁蛋白

26图 2 骨密度 T 值随年龄、铁蛋白、骨铁、转铁蛋白及 BMI 变化趋势（A-B.腰椎及髋部 TRC-D.腰椎及髋部 BMI；E-F.腰椎及髋部骨铁；G-H.腰椎及髋部年龄；I-J.腰椎及髋部 Fer）A B
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R683

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