Piezo1在骨肉瘤细胞中的表达及对其生物学功能的影响

发布时间：2020-06-14 14:30

【摘要】：实验目的:研究机械牵张应力模型中骨肉瘤细胞中Piezo1表达的变化,并探究shRNA-Piezo1下调Piezo1的表达后对骨肉瘤细胞的增殖和凋亡的影响。实验方法:构建沉默Piezo1表达的慢病毒,转染对数期生长的骨肉瘤MG63和U2细胞株;将实验分为空白对照组(无慢病毒转染细胞),阴性对照组(无序序列质粒慢病毒转染细胞)和ShPiezo1组(shRNA Piezo1干扰序列质粒慢病毒转染细胞);利用Flexcell细胞牵张应力加载系统构建体外机械牵张应力的细胞模型(根据预实验设0h、2h、12h、24h、48h机械牵张应力组);用Western-blot和RT-qPCR检测骨肉瘤细胞中Piezo1的表达量;通过免疫荧光对Piezo1蛋白在骨肉瘤细胞中的表达进行定位检测;用CCK-8法检测骨肉瘤细胞的增殖情况;用AV-PI凋亡试剂盒检测骨肉瘤细胞的凋亡情况。实验结果:(1)成功包装慢病毒载体,并成功转染骨肉瘤MG63和U2细胞株,RT-qPCR和Western-blot检测结果显示:骨肉瘤两种细胞株中Piezo1表达无明显差异,选用MG63型细胞株作为本实验所用细胞。(2)RT-qPCR检测结果显示:Piezo1在加载不同时间的机械牵张应力下的骨肉瘤细胞中表达不同,在24h机械牵张应力下表达量最高(P0.05)。ShPiezo1组细胞,Piezo1的表达较空白对照组均有所下降(P0.05)。(3)Western-blot结果显示:Piezo1蛋白在加载不同时间的机械牵张应力下的骨肉瘤细胞中表达不同,在24h机械牵张应力下表达量最高(P0.05)。ShPiezo1组细胞,Piezo1蛋白均无明显表达。(4)免疫荧光结果显示:空白对照组中Piezo1蛋白在骨肉瘤细胞膜上表达,ShPiezo1组骨肉瘤细胞Piezo1蛋白的表达明显低于空白对照组。(5)CCK-8实验结果显示:对骨肉瘤细胞加载不同时间的机械牵张应力,会影响细胞的增殖率。在加载24h机械牵张应力后,骨肉瘤细胞增殖率最低(P0.05)。ShPiezo1组细胞,骨肉瘤细胞的增殖率在12h、24h、48h机械牵张应力后较空白对照组显著增高(P0.05)。(6)AV-PI实验结果显示:不同时间的机械牵张应力会影响骨肉瘤细胞的凋亡率。骨肉瘤细胞在加载2h机械牵张应力后,细胞早期凋亡率最高(P0.05),在加载24h机械牵张应力后细胞晚期凋亡率最高(P0.05),并且总的凋亡率也是最高(P0.05)。ShPiezo1组细胞,在加载12h、24h、48h机械牵张应力后,细胞晚期凋亡率和总凋亡率出现下降(P0.05)。结论:体外实验机械敏感性离子通道Piezo1蛋白能在人骨肉瘤细胞中表达,Piezo1能抑制骨肉瘤细胞的增殖,促进骨肉瘤细胞的凋亡。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738.1
【图文】：

图 1 A LV3 慢病毒载体构建模式图；B、C 质粒构建模式图；D、在 0.11μL 和 0.033μL 阴性对照的病毒滴度（100×）；E、在 0.11μL 和 0.033μLPiezo1-shRNA 组的病毒滴度（100×）. 骨肉瘤细胞中 Piezo1 的 mRNA 及蛋白的表达水平.1.骨肉瘤 MG63、U2 细胞中 Piezo1 的表达及有效 Piezo1-shRNA 慢病毒载体的筛选结检测结果分别为 LV3-Piezo1-homo-2844，LV3-Piezo1-homo-3201，LV3-Piezo1-omo-4155 和阴性序列对照组（图 2）。RT-PCR（图 2B）结果显示：骨肉瘤细胞 MG63、 U2 组中的各转染组的 Piezo1 表达无明显差异，骨肉瘤细胞 MG63 组、 U2 组中通 LV3-PIEZO1-homo-3201 慢病毒载体转染后的细胞 Piezo1 的表达量最低。

宁夏医科大学硕士研究生学位论文 结果- 22 -图3 空白对照组和ShPiezo1组的RT-qPCR、western-blot的检测结果A. 空白对照组和ShPiezo1组的RT-qPCR检测结果；B. 空白对照组和ShPiezo1组的Western-Blot的检测结果；C.Image J 软件分析Western-Blot蛋白条带的灰度值注：n.s.表示P ＞0.05；* 表示P＜0.05；** 表示P＜0

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本文编号：2712920