吗啡预处理调控NGF诱导的神经细胞TRPV1通道敏化的作用及信号机制

发布时间：2020-06-19 04:21

【摘要】：目的:研究吗啡预处理对神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)诱导的神经细胞瞬态电压感受器离子通道1(Transient receptor potential vanilloid1,TRPV1)敏化的抑制作用及信号通路,以探讨其调控心肌缺血伤害感受信号传导的可能机制。方法:原代培养2日龄SD大鼠背根神经节(Dorsal root ganglia,DRG)神经元或大鼠嗜铬瘤细胞(Pheochromocytoma cell,PC12),接种于24孔板或6孔板中,均随机分为8组:对照组(CON组)、辣椒素刺激组(CAP组)、NGF敏化组(NGF组)、不同浓度吗啡预处理组(MPC0.3组、MPC1.0组、MPC3.0组)、TRPV1通道阻断剂组(I-RTX组)、TRPV1阻断剂+NGF敏化组(I-RTX+NGF组)。CON组细胞正常培养,CAP组细胞予以100nmol/L辣椒素刺激,NGF组细胞加入100ng/m L NGF孵育1h,不同浓度MPC组细胞于NGF孵育前分别予以终浓度为0.3、1.0、3.0?mol/L的含吗啡培养液孵育10分钟,洗脱30分钟,I-RTX组及I-RTX+NGF组细胞分别在CAP组及NGF组细胞的基础上予以100nmol/L I-RTX共同孵育。各组DRG神经元在100nmol/L辣椒素刺激后,即刻采用全细胞膜片钳技术检测辣椒素诱发内向电流;免疫荧光双标染色法观察P物质(Substance P,SP)及降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)蛋白共表达情况;各组PC12细胞均予以Western blot法检测TRPV1、磷酸化TRPV1(Phosphorylated TRPV1,p TRPV1)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p ERK1/2)及磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,p AKT)相对表达水平。结果:DRG神经元膜片钳结果显示,与CON组比较,CAP组的辣椒素诱发内向电流幅度增加(P0.05),而I-RTX可以抑制其电流幅度(P0.05);与CAP组比较,NGF组辣椒素诱发内向电流振幅增加(P0.05),而各浓度吗啡预处理组及I-RTX均可以对其产生抑制作用(P0.05)。免疫荧光双标染色结果表明,SP及CGRP在DRG神经元中存在共表达,与CAP组相比,NGF组可见SP及CGRP蛋白由神经元胞体转向突触的表达增加,而吗啡预处理可以抑制这种表达;I-RTX+NGF组SP及CGRP共表达量较其他各组均明显减少。PC12神经细胞Western blot结果显示,与CON组相比,CAP组TRPV1蛋白、p TRPV1蛋白、p ERK1/2蛋白及p AKT蛋白表达均上调(P0.05),而I-RTX可以抑制其上调(P0.05);NGF刺激可进一步增加TRPV1蛋白、p TRPV1蛋白以及p ERK1/2与p AKT蛋白表达水平(P0.05),但TRPV1阻断剂I-RTX可抑制上述蛋白表达(P0.05)。与NGF组相比,各浓度MPC组p ERK1/2、p AKT、p TRPV1表达均下调(P0.05)。结论:NGF可诱导神经元TRPV1通道敏化,并激活其下游的ERK1/2及AKT信号通路,引起神经元肽类物质的释放;吗啡预处理可能通过抑制NGF诱导的TRPV1通道敏化及下游信号通路活化,调控心肌缺血伤害感受信号的传导。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614
【图文】：

示意图,细胞,辣椒素,膜片钳技术

图 1：细胞实验分组示意图：CON 组与 CAP 组细胞正常培养，NGF 组细胞予以含 NGF 100ng/mL 的神经元培养基培养 1h，不同浓度 MPC 组细胞于 NGF 培养前分别予以终浓度为 0.3、1.0、3.0 mol/L 的含吗啡的神经元培养液孵育 10 分钟后，换用无吗啡培养基培养 30 分钟。进过上述处理后，CON 组细胞直接采用单细胞膜片钳技术检测细胞膜电流变化，两抑制剂组细胞先予以终浓度 100nmol/L I-RTX 单独作用 20s，再与100nmol/L 辣椒素共同处理，即刻采用单细胞膜片钳技术检测细胞膜电流变化。其余 5 组 DRG 神经元均予以100nmol/L 辣椒素刺激，即刻记录细胞电流变化。其中，CON 组、CAP 组、NGF 组、MPC1.0 组、I-RTX+NGF组 5 组 DRG 神经元中，随机选取一孔细胞用于免疫荧光双标染色，CON 组及 CAP 组细胞正常培养，NGF组细胞加入 100ng/mL NGF 培养 1h，MPC 组细胞于 NGF 培养前予以终浓度为 1.0 mol/L 的含吗啡神经元培养液孵育 10 分钟后，再换为无吗啡的神经元培养液培养 30 分钟，I-RTX+NGF 组于 NGF 孵育前予以含100nmol/L I-RTX 神经元培养液孵育 10 分钟。上述处理后，除去 CON 组外，各组 DRG 神经元均予以 100nmol/L辣椒素孵育 30 分钟后，用于免疫荧光双标染色。

细胞,培养液,培养基,辣椒素

图 2：分子实验分组图示：CON 组及 CAP 组细胞正常培养，NGF 组细胞加入 100ng/mL NGF 培养 1h，不同浓度 MPC 组细胞于 NGF 培养前分别予以终浓度为 0.3、1.0、3.0 mol/L 的含吗啡的高糖 DMEM 培养液孵育10 分钟后，再换为无吗啡的培养基培养 30 分钟。I-RTX 组予以含终浓度 100nmol/L I-RTX 的高糖 DMEM 孵育 10 分钟，I-RTX+NGF 组于 NGF 孵育前予以含 100nmol/L I-RTX 培养基孵育 10 分钟。上述处理后，除去CON 组外，各组 PC12 细胞均予以 100nmol/L 辣椒素孵育 30 分钟后，收集细胞蛋白用于 Western blot 法检测。Fig 2. The group schematic diagram of molecule experiment. The cells in group CON were cultured in normalculture condition, and the cells in group CAP were stimulated by 100nmol/L capsaicin while in group NGF the cellswere treated with 100nmol/L NGF for 1 hour. In addition, in group MPC0.3, MPC1.0 and MPC3.0, the cells werepretreated with 0.3μmol/L, 1.0μmol/L or 3.0μmol/L morphine for 10min, followed by wash-out for 30min,respectively, prior to the addition of NGF. Meanwhile, the cells in group I-RTX and I-RTX+NGF were stimulated by100nmol/L I-RTX for 20 second, followed by the co-stimulation of 100nmol/L capsaicin and I-RTX. Afterwards, the

【参考文献】