脂肪干细胞胶通过分泌成血管因子促进小鼠创面愈合的实验研究

发布时间：2020-06-19 21:49

【摘要】：研究背景和目的创面愈合是一个非常复杂的过程,是现代医学的重大挑战。造成创面不愈合的因素很多,其中细胞因子的分泌的减少及血管形成受限是重要原因。由于具有多向分化潜能,免疫调节功能以及旁分泌作用,以间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)为核心的细胞疗法逐渐成为治疗创面的新选择。其中,脂肪来源干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ASCs)可轻易并大量地从脂肪组织中获取,是细胞疗法中重要的干细胞来源。然而,目前分离及培养ASCs需要胶原酶及血清的使用,增加了生物污染的风险。此外,在体外扩增出一定量的ASCs需要特定的实验条件且可能耗费数天到数周的时间。另外,许多研究表明,单纯将ASCs悬液注入创面后,ASCs常因局部缺血而死亡且部分存留的ASCs易被宿主免疫系统消除。所有这些因素都会对削弱以ASCs为基础的细胞疗法的疗效以及应用。最近我们实验团队制作并命名了一种新的脂肪组织来源的,可注射的脂肪干细胞胶(Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel,ECM/SVF-Gel)。通过物理剪切力的作用,ECM/SVF-Gel消除了脂肪中大部分脂类和其他不需要的成分,留下的主要是细胞外基质(ECM)和SVF细胞,从而大大提高ASCs细胞的密度。因为ECM/SVF-Gel中含有丰富的ASCs,我们推测,ECM/SVF-Gel可以发挥细胞疗法的作用,促进创面愈合。为了检验这一假设,我们开展体内外实验进行ECM/SVF-Gel对于创面修复治疗的评估。方法与实验结果首先,我们在体外评估了 ECM/SVF-Gel提取物中血管生成因子的表达及其促进血管生成的作用(成管能力鉴定)。接下来,我们在小鼠体内评估了 ECM/SVF-Gel促进创面愈合的能力。体内将ECM/SVF-Gel应用于裸鼠创面,对照组使用SVF细胞悬液和磷酸盐缓冲生理盐水注射液。在不同时间点对体内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)进行分析并测定了皮肤血管密度。结果表明,与对照组相比,ECM/SVF-Gel提取物含有高浓度的VEGF和bFGF并可以在体外诱导血管生成。体内表明ECM/SVF-Gel相较于对照组能够有效促进创面愈合,炎症趋化因子MCP-1在创面愈合早期阶段呈高表达,而在后期急剧降低。结论1、ECM/SVF-gel能促进创面愈合,其效果优于SVF细胞悬液,在创面干细胞治疗领域有较好的应用前景。2、ECM/SVF-gel能够通过分泌成血管因子促进创面血管化。3、ECM/SVF-gel成血管因子的分泌可能与早期强烈的炎症反应有关。4、ECM/SVF-Gel中高度浓缩的ECM成分可能是促进其更好地发挥细胞疗法的重要因素。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R64
【图文】：

示意图,示意图,脂肪组织,注射器

图１：邋ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ的制备示意图。吸脂术后获取的脂肪组织１２００ｇ离心３分逡逑钟，制成Ｃｏｌｅｍａｎ脂肪；然后在两个联通的注射器内以１０ｍｌ／ｓｅｃ速度推注一分逡逑钟使脂肪组织乳糜化；２０００ｇ离心３分钟，中间层组织即为ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ：邋Ｔｈｅ邋ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ．邋Ａｄｉｐｏｓｅ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｂｔａｉｎｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ逡逑ｗａｓ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ邋ａｔ邋１２００邋ｇ邋ｆｏｒ邋３邋ｍｉｎｕｔｅｓ邋ｔｏ邋ｍａｋｅ邋Ｃｏｌｅｍａｎ邋ｆａｔ；邋ｔｈｅｎ邋ｉｎ邋ａ邋ｔｗｏ－ｐａｓｓ邋ｓｙｒｉｎｇｅ逡逑ｔｈｅ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ａｔ邋ａ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋１０邋ｍｌ／ｓｅｃ邋ｆｏｒ邋１邋ｍｉｎｕｔｅ邋ｔｏ邋ｍａｋｅ邋ｔｈｅ邋ａｄｉｐｏｓｅ逡逑ｔｉｓｓｕｅ邋ｍｉｌｋｙ；邋ｔｈｅ邋２０００邋ｇ邋ｗａｓ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ邋ｆｏｒ邋３邋ｍｉｎｕｔｅｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｍｉｄｄｌｅ邋ｌａｙｅｒ逡逑ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ邋ｗａｓ邋Ｆｏｒ邋ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ．逡逑２．邋ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ电子显微镜扫描观察逡逑Ａ．取材：将制备的ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ组织由２７Ｇ针头的注射器注射至滤纸表面，逡逑组织体积不超过８ｍｍ邋ｘ８ｍｍ邋ｘ５ｍｍ，充分暴露待观察组织表面。逡逑Ｂ．清洗：ＰＢＳ液反复喷洗，去除组织表面血液或组织液，清晰暴露组织游逡逑

脂肪组织,结构特征,机械加工

图２：邋ＥＣＭ邋／邋ＳＶＦ－ｇｅｌ和新鲜脂肪组织的结构特征。通过ＳＥＭ评估ＥＣＭ邋／逡逑ＳＶＦ－ｇｅｌ和新鲜脂肪组织。对照脂肪组织具有相对良好的完整的ＥＣＭ结构（图逡逑２（ａ））。机械加工后ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ中的ＥＣＭ完整性略有下降（图２（ｂ））。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２：邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ邋ａｎｄ邋Ｆｒｅｓｈ邋Ａｄｉｐｏｓｅ邋Ｔｉｓｓｕｅｓ．逡逑ＥＣＭ／ＳＶＦ－ｇｅｌ邋ａｎｄ邋ｆｒｅｓｈ邋ａｄｉｐｏｓｅ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｅｖａｌｕａｔｅｄ邋ｂｙ邋ＳＥＭ．邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ａｄｉｐｏｓｅ逡逑１８逡逑

【参考文献】