TERT促进骨肉瘤细胞耐药的研究及其作用机制

发布时间：2020-07-02 18:44

【摘要】：骨肉瘤是青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤,具有较高的致残、致死率,单纯手术治疗的5年生存率仅20%。自上世纪70年代末引入化疗以来,确诊为骨肉瘤的患者在接受药物治疗后5年生存率明显提高。同时,保肢手术配合关节假体的开展使患者能够恢复患肢的功能和外形。因此,骨肉瘤患者的远期生存和生活质量得到明显提高。目前,如何解决化疗耐药成为临床上的棘手问题。首先,化疗耐药使得骨肉瘤患者需改用高强度化疗方案,必然会带来极大的全身不良反应。第二,化疗耐药导致骨肉瘤患者局部复发,使保肢术后再次截肢,给患者造成严重的心理负担,加速疾病发展。第三,长期的化疗失败使得肿瘤发生广泛的肺转移,最终造成呼吸衰竭及多器官不可逆衰竭。目前这类患者的5年生存率不足20%。端粒是真核细胞染色体末端、有着重要生物学功能的特殊结构。端粒酶是维持端粒长度的关节酶,由端粒酶催化亚基端粒酶逆转录酶(TERT)、端粒RNA(TERC)及端粒酶相关蛋白(TP)等3部分组成。正常机体内,端粒酶仅存在于精原细胞及少量体细胞内。而大部分肿瘤中,均可检测到端粒酶的活性。TERT与肿瘤的关系一直是研究的热点,TERT参与肿瘤周期改变、细胞凋亡发生,在转录和翻译水平参与癌基因组的激活或抑制。而作为最有效的化疗药物之一的顺铂,主要作用靶点为细胞DNA,干扰DNA复制,诱导细胞凋亡。因此,TERT与顺铂在骨肉瘤的关系值得进一步探讨。第一部分TERT线粒体转移参与骨肉瘤细胞耐药研究[目的]通过顺铂处理骨肉瘤细胞,同普通培养的骨肉瘤细胞相比,探究耐药骨肉瘤细胞和非耐药骨肉瘤细胞中TERT的表达及定位情况。[方法]通过获取并培养骨肉瘤细胞系MG63、U20S和143B于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM完全培养基中。通过qRT-PCR法和Western-blot法检测并比较5μmol/L的顺铂处理24小时后的骨肉瘤细胞中TERTmRNA和蛋白表达情况,并利用共聚焦免疫荧光显微镜观测TERT表达位置。随后通过Western-blot法检测并比较两组骨肉瘤细胞线粒体中TERT蛋白表达水平。[结果]骨肉瘤耐药细胞中TERT mRNA和蛋白表达水平均高于正常骨肉瘤细胞。TERT在骨肉瘤耐药细胞中发生了线粒体转移。[结论]骨肉瘤耐药细胞中TERT表达明显升高,并向线粒体进行转移。第二部分TERT抑制线粒体凋亡通路及降低胞内ROS水平促进骨肉瘤细胞耐药[目的]探究TERT在骨肉瘤细胞耐药中所起的作用及机制。[方法]合成TERT慢病毒并感染至骨肉瘤细胞中,通过嘌呤霉素筛选获得稳定感染的骨肉瘤细胞系TERT野生型(TERT-WT)、TERT突变型(TERT-CI)、TERT低表达型(TERT-siRNA)和空转对照(Control)。利用Western-blot法对4组骨肉瘤细胞TERT表达情况进行检测。5μmol/L的顺铂处理4组骨肉瘤细胞24小时后,通过流式细胞仪及免疫荧光显微镜检测细胞凋亡情况。利用Western-blot法检测4组细胞线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl表达情况。通过caspase-3、细胞色素c氧化酶(COX)试剂盒检测4组细胞caspase-3和COX活性。利用流式细胞仪检测4组骨肉瘤细胞内ROS水平。通过谷胱甘肽(GSH/GSSG)试剂盒检测4组骨肉瘤细胞0至6小时内GSH/GSSG比例情况,通过谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)试剂盒检测4组骨肉瘤细胞GPx和GR活性。[结果]成功构建TERT-WT、TERT-CI、TERT-siRNA和Control稳转骨肉瘤细胞系。通过Western-blot法检测发现TERT-WT和TERT-CI骨肉瘤细胞中TERT表达量升高且无统计学差异,TERT-siRNA骨肉瘤细胞中TERT表达量明显降低。流式细胞仪及免疫荧光显微镜检测4组骨肉瘤细胞凋亡水平发现,TERT-WT和TERT-CI细胞中凋亡比率明显降低且无统计学差异,而TERT-siRNA细胞中凋亡比率明显升高。利用Western-blot法发现TERT-WT和TERT-CI细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达明显升高而促凋亡蛋白Bax表达显著降低,在TERT-siRNA细胞中三种凋亡蛋白的表达情况完全相反。检测Caspase-3活性发现TERT-WT和TERT-CI细胞中caspase-3活性降低,而TERT-siRNA细胞中caspase-3活性增强。COX活性检测显示TERT-WT和TERT-CI细胞中COX活性明显升高,而TERT-siRNA细胞中COX活性明显降低。利用流式细胞仪检测了四组骨肉瘤细胞内ROS水平,在顺铂处理后的TERT-WT和TERT-CI骨肉瘤细胞中,ROS水平明显降低,而TERT-siRNA骨肉瘤细胞中ROS水平明显升高。谷胱甘肽检测发现顺铂处理4组骨肉瘤细胞后的第6小时,TERT-WT和TERT-CI骨肉瘤细胞中GSH/GSSG水平明显升高,而TERT-siRNA骨肉瘤细胞中GSH/GSSG水平明显降低。GPx和GR胞内活性检测显示,TERT-WT和TERT-CI骨肉瘤细胞中GPx和GR活性明显升高,而TERT-siRNA骨肉瘤细胞中GPx和GR活性明显降低。[结论]TERT通过线粒体途径抑制顺铂对骨肉瘤细胞诱导的凋亡并降低胞内ROS水平,且这种作用不依赖端粒酶活性。第三部分TERT促进骨肉瘤细胞耐药体内实验研究与机制[目的]体内实验验证TERT增强骨肉瘤细胞耐药的作用并绘制机制网络图。[方法]取24只裸鼠随机分为4组,每组6只。4组裸鼠分别接种TERT-WT、TERT-Cl、TERT-siRNA和Control143B骨肉瘤细胞构建移植瘤模型。于骨肉瘤细胞接种后第4周开始使用浓度为5mg/kg的顺铂,每周1次,持续4周。监测肿瘤大小8周,每周测量移植瘤体积并重复三次。于第八周检测4组裸鼠中移植瘤重量。Western-blot法检测4组移植瘤组织中Bax、Bcl-2和Bcl-xl的表达水平。[结果]TERT-WT和TERT-CI异种移植瘤在第4周体积无明显区别。TERT-siRNA异种移植瘤生长的最慢,且在第4周时肿瘤的体积最小。顺铂处理4周后,相比对照组移植瘤,TERT-WT和TERT-CI异种移植瘤体积和重量最大,而TERT-siRNA异种移植瘤体积和重量最小。对四种异种移植瘤组织进行Western-blot检测凋亡蛋白表达水平发现,TERT-WT和TERT-CI异种移植瘤中Bax表达水平最低,而TERT-siRNA异种移植瘤中Bax表达水平最高。Bcl-2和Bcl-xl在TERT-WT和TERT-CI异种移植瘤中表达水平最高,而在TERT-siRNA异种移植瘤中表达水平最低。[结论]体外实验证明TERT增强骨肉瘤异种移植瘤抵抗顺铂的能力。TERT通过降低骨肉瘤细胞内ROS水平,抑制线粒体凋亡通路从而使骨肉瘤细胞免于顺铂的杀伤。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738.1
【图文】：

骨肉瘤,顺铂,印迹技术,水平表

逡逑附图１逡逑＾邋Ｃ逦■邋Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ邋＾逡逑Ｉ邋３］逦＊逦■邋Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ逡逑＾邋＊逡逑Ｓ邋２＿逦ＪＭ逦＾逦ＭＧ６３逦Ｕ２０Ｓ逦１４３Ｂ逡逑§逦Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ邋Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ邋Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ邋Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ邋Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ邋Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ逡逑＾１－逦■逦逦逦邋—邋ＴＥＲＴ逡逑１邋１１邋ｌ邋ｌ逦－逡逑ａ邋ＭＧ６３邋Ｕ２０Ｓ邋１４３Ｂ逡逑图１－１．骨肉瘤耐药细胞中ＴＥＲＴ表达量的改变。Ａ利用ｑＲＴ－ＰＣＲ检测顺铂处理前逡逑后的三种骨肉瘤细胞中ＴＥＲＴｍＲＮＡ水平表达情况（＊Ｐ＜０．０５）。Ｂ利用Ｗｅｓｔｅｒｎ免逡逑疫印迹技术检测顺铂处理前后的三种骨肉瘤细胞中ＴＥＲＴ蛋白水平表达情况逡逑（叩＜０．０５）。逡逑１１逡逑

骨肉瘤,线粒体,顺铂,印迹技术

【参考文献】