长链非编码RNA-UCA1通过miR-18a靶向YAP1调控乳腺癌曲妥珠单抗耐药

发布时间：2020-07-04 16:28

【摘要】：【背景】据美国癌症协会最新流行病学调查数据显示,乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤首位。人表皮生长因子受体2(英文名为Human epidermal growth factor receptor-2,英文简称为HER2)在约20%~25%乳腺癌患者中过度表达,与疾病进展及预后密切相关,是乳腺癌治疗的重要靶点之一。HER2靶向药物—曲妥珠单抗(Trastuzumab,商品名Herceptin,赫赛汀)在乳腺癌治疗中具有较大的临床获益。最近的研究发现非编码RNA在调控肿瘤耐药方面发挥重要作用。微小RNA(miRNA)通过靶向降解靶mRNA调控基因表达。我们连续的研究表明,miR-200c(Bai et al,Int J Cancer,2014)、miR-221(Ye et al,BMB Rep,2014)和miR-375(Ye et al,BMC Cancer,2014)等广泛参与乳腺癌HER2靶向治疗的耐药调控。这些结果说明miRNA在乳腺癌HER2靶向治疗耐药中扮演重要角色。然而,miRNA仅仅是转录后调节的一个作用环节,并不能完全解释乳腺癌HER2靶向治疗耐药相关基因的异常表达。近年来,长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)被证明在多种疾病中调控基因异常表达,且与肿瘤细胞增殖、迁移、血管生成、侵袭、转移和抗肿瘤药物耐药性有关。然而,是否有与曲妥珠单抗耐药有关的LncRNA同时调控细胞恶性转化?LncRNA与miRNA以及靶基因的mRNA如何相互作用?这些RNA调控网络又是如何参与乳腺癌耐药?这些问题目前仍未阐明。瘢痕疙瘩是一种皮肤良性肿瘤,其特征是成纤维细胞过度生长和胶原过度沉积在受损伤的皮肤细胞外基质中。许多研究表明PPAR-γ激动剂在肾脏、肝脏、胰腺和肺部具有抗纤维化作用,表明PPAR-γ激动剂可能成为一种有前途的控制纤维化疾病的药物。人工合成的PPAR-γ激活剂,如曲格列酮等能激活PPAR-γ。PPAR-γ是核受体,能够与靶基因的DNA上的过氧化物酶体增殖激素应答元件(PPRE)结合激活转录,从而调节多种生理现象。然而,尽管我们认识到PPAR-γ激动剂抗纤维化的功能,但是在瘢痕疙瘩成纤维细胞中PPAR-γ激动剂抗纤维化作用的分子机制仍有待确定。研究显示,部分微小RNA(miRNA)具有调控纤维化的作用。我们连续的研究表明,miR-21和miR-145广泛参与皮肤纤维化进程。然而,是否有与PPAR-γ激动剂治疗抗纤维化作用有关的miRNA参与瘢痕发生?PPAR-γ激动剂如何在瘢痕疙瘩中调控miRNA?miRNA以及靶基因又是如何参与PPAR-γ激动剂拮抗瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原生成?这些问题亟需解答。【目的】通过本研究的实施,鉴定乳腺癌曲妥珠单抗耐药细胞中与耐药相关的长链非编码RNA,并筛选出受到该长链非编码RNA调控的miRNA分子以及靶基因,进而从LncRNA“海绵吸附”miRNA的机制出发,探讨长链非编码RNA在乳腺癌耐药过程中的功能,并为乳腺癌治疗提供新的靶点分子和策略。通过本研究的实施,验证PPAR-γ激动剂抑制瘢痕疙瘩胶原合成的现象,并筛选出受到PPAR-γ激动剂调控的miRNA分子及其靶基因,探讨靶基因Egr1对胶原生成的影响,并为瘢痕疙瘩治疗提供新的候选靶点。【方法】1.采用qRT-PCR分析UCA1、miR-18a和YAP1的表达;2.通过细胞增殖实验分析UCA1对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞增殖的影响,并测定曲妥珠单抗半数致死浓度;3.通过流式细胞术凋亡分析检测UCA1对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞凋亡的影响;4.通过Transwell细胞侵袭实验分析UCA1对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞侵袭能力的影响;5.生物信息学方法预测UCA1和miR-18a、miR-18a和YAP1的结合位点;6.利用荧光素酶报告基因实验分析UCA1和miR-18a、miR-18a和YAP1的结合情况;7.采用生物素下拉实验检测UCA1和miR-18a相互结合;8.采用瞬时转染分析干涉UCA1、miR-18a和YAP1的表达对上下游基因表达的影响。1.采用qRT-PCR分析Egr1、miRNA和Col1的表达;2.通过蛋白印迹和酶联免疫吸附实验检测Egr1和Col1蛋白含量;3.通过免疫组化实验检测瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中Egr1的表达;4.通过miRNA芯片高通量筛选PPAR-γ激动剂处理后瘢痕疙瘩成纤维细胞的miRNA表达谱,筛选出能够调控胶原的miRNA分子(miR-543);5.通过瞬时转染检测miRNA对胶原分泌的影响;6.通过染色质免疫沉淀实验检测PPAR-γ在miR-543启动子区的结合;7.生物信息学方法预测miR-543启动子区的过氧化物酶体增殖激素应答元件序列,以及miR-543和Egr1的结合位点;8.利用荧光素酶报告基因实验分析miR-543和Egr1结合情况。【结果】1.qRT-PCR结果显示,长链非编码RNA-UCA1在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞中表达升高;2.UCA1干涉结果显示,干涉后长链非编码RNA-UCA1在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞中显著降低;3.细胞增殖实验和细胞侵袭实验的结果显示,UCA1干涉显著降低曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞增殖和侵袭能力;4.生物素RNA下拉结果显示,UCA1和miR-18a在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌SKBR3细胞中相互结合;5.生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验证实UCA1能“海绵吸附”miR-18a,并且这种吸附作用依赖两者的结合位点;6.qRT-PCR结果显示,降低UCA1能显著升高miR-18a的水平,而升高的miR-18a抑制YAP1的表达;7.生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验证实,miR-18a能靶向抑制YAP1,并且这种抑制作用依赖于两者的结合位点;8.qRT-PCR和蛋白印迹实验结果显示,降低UCA1和YAP1能显著抑制促细胞分裂的分子的表达,提高促药物敏感性蛋白的表达量;9.干涉UCA1实验发现,在miR-18a干涉的条件下,UCA1不能对miR-18a下游基因进行调控。1.qRT-PCR结果显示,在瘢痕疙瘩成纤维细胞中,Egr1和Col1在接受PPAR-γ刺激下降低,而miR-543表达升高;2.蛋白印迹和酶联免疫吸附实验显示,Egr1和Col1蛋白表达水平一致;3.miRNA芯片结果显示,miR-543等miRNA在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达异常,qRT-PCR证实了芯片检测结果;4.生物信息学结果显示,miR-543启动子区有过氧化物酶体增殖激素应答元件序列,在Egr1的3’UTR区有miR-543的候选结合位点;5.荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-543能结合Egr1的3’UTR;6.qRT-PCR实验结果显示,Egr1在曲格列酮刺激和miR-543抑制物同时作用时升高,在PPAR-γ抑制物和miR-543模拟物同时作用时降低;7.酶联免疫吸附实验结果显示,Col1蛋白表达变化和Egr表达变化一致。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

示意图,单抗,机制,示意图

空军军医大学博士学位论文2 下游途径失活[40]。另外，阻断 HER2 / HER3 / PI3K 复合物形成和下t 信号传递是曲妥珠单抗抑制肿瘤细胞增殖的关键分子机制（图 1）[4珠单抗治疗，肿瘤细胞在细胞周期的 G1 / S 期停滞，并伴随着 p27 水细胞周期蛋白 D1 的降低[42]。当单一应用于体外实验中时，曲妥珠单胞凋亡[43]。当曲妥珠单抗与化疗药物联合应用时，这种协同效应可以 / Akt 信号传导途径抑制肿瘤细胞生长。在诱导免疫系统介导的抗肿相关研究显示曲妥珠单抗能够介导免疫应答，例如抗体依赖性细胞毒）和补体依赖性细胞毒性[44]。在 ADCC 中，表达 Fc 受体的免疫效应G1 抗体（曲妥珠单抗）的 Fc 结构域结合，随后裂解与抗体相连的细细胞）。Gennari 等学者发现曲妥珠单抗治疗后的肿瘤样品中淋巴样，证实了曲妥珠单抗在乳腺癌患者中介导 ADCC 的作用[45]。

示意图,耐药机制,示意图,单抗

R 是一种受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK），是 PI3因素。Lu 等学者报道，过度表达 HER2 和 IGF-1R 的细胞（MCF显示出对曲妥珠单抗的耐药性（图 2），若用抗体阻断 IGF-1R，例，能够抵消该细胞的耐药性[48]。Lu 等学者随后也报道了 IGF-1 信的表达水平，证实 SKP2 是 p27 的泛素连接酶，能够增强 SKP2 与们课题组前期研究显示，IGF-1R 在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌 SK达。若干涉 IGF-1R，曲妥珠单抗耐药细胞药物敏感性增强[13]。这用 IGF-1R 的抑制剂 -IR3，可提高曲妥珠单抗耐药细胞的药物敏rega 等学者发现过表达 TGF- （Transforming growth factor- ，转化胞对曲妥珠单抗可产生耐药性。Valabrega 收集了曲妥珠单抗治疗情进展的乳腺癌患者的肿瘤样品，并对其 TGF- 表达水平进行了显示，在治疗前检测不到 TGF- 表达，但在治疗后出现病情进展 TGF- 表达显著升高[50]。

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