修饰玻璃酸钠组织工程软骨支架的制备及应用研究

发布时间：2020-07-05 01:33

【摘要】：研究背景:目前,受损的透明软骨是数百万年轻人和老年人经历的膝关节疼痛的罪魁祸首。由于急性创伤、日常磨损、衰老或疾病导致的软骨损伤可引起间歇性或慢性疼痛,并可伴有肿胀、关节交锁、周围肌肉减弱或运动范围减小等。玻璃酸(Hyaluronic acid,HA)是糖胺聚糖的一种,其由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-葡糖胺的重复二糖单元组成。HA是皮肤、玻璃体、滑液和软骨等组织中细胞外基质的重要组成部分,具有独特的物理化学特性和生物学功能。HA作为软骨细胞生长的底物是软骨基质的重要组成部分,它可以促进软骨细胞的代谢,刺激软骨基质的形成,维持软骨细胞的表型。在构建软骨细胞支架时,它被认为是最合适的材料之一。具有吸湿性和高水溶性的天然HA是具有长直链的聚合物。它们易于通过身体组织中的固有酶或自由基分布和消化。当应用于身体的局部组织时,其天然形式的可注射HA仅持续1-2天。非交联HA的机械强度不能满足组织工程支架的要求。通过交联能够形成稳定的HA聚合物网络。可通过控制交联度和工艺参数修饰玻璃酸钠来制备可生物降解和多孔的材料,这将是软骨组织工程的潜在支架。使用交联 HA(Cross-linked sodium hyaluronate,CHA)与 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-Butanedioldiglycidylether,BDDE)作为交联剂的可注射凝胶来治疗骨关节炎(Osteoarthritis,OA)、软组织缺损和填充真皮组织。这些产品的有效性和安全性己在临床试验中得到证实。然而,CHA在组织工程中的价值至今尚未阐明。最近的报道表明,人类干细胞,特别是间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),在关节软骨疾病的治疗中产生了积极的结果。人类MSCs可以从多种成人组织中获得,易于扩增,随后分化为可产生基质的软骨细胞,最终促进透明关节软骨的形成。MSCs易于分离,其表型得以维持,因为它们与衰老无关。此外,它们具有优于其他软骨细胞的优异的初始增殖能力。由于多能干细胞(例如,诱导的多能干细胞或胚胎干细胞)具有潜在的畸胎瘤形成风险,与软骨组织工程中的MSC相比,它们并不适合用于软骨修复。然而,组织工程软骨尚未完全具有天然关节软骨的结构和功能特性,限制了其广泛应用于临床。因此,迄今为止,关节软骨修复尚无可靠的长期治疗策略。常规疗法(例如:微骨折、镶嵌成形术和软骨扩增移植术)或传统疗法(例如:关节外科手术)具有若干缺点。在关节外科手术中,进行假体装置的植入以替换软骨生物组织,其可以挽救部分关节功能,但仅仅可维持10-15年。该手术无法避免手术后并发症的风险,包括感染和炎症。因此,迫切需要有效治疗以成功修复或再生关节软骨组织。橙皮苷在许多疾病模型中表现出抗炎特性。例如,橙皮苷已经在啮齿动物模型中显示出通过抑制细胞因子产生,降低NF-κB活性和减轻氧化应激反应来减少炎症以及炎症疼痛。在应用橙皮苷的动物模型中,渗出物LPO减少,但SOD和GSH增加。这些影响表明橙皮苷具有抗过氧化作用。然而,在组织内的环境下,给予橙皮苷导致LPO、SOD、CAT和GSH降低,进一步表明其可抑制氧化应激反应的增加。有趣的是,在血清中它只能降低CAT和GSH,而对LPO和SOD没有任何显着影响。这些观察结果表明,橙皮苷可能不会在体内降低总体氧化应激,但只是逆转炎症变化,从而降低组织和渗出液中的LPO。然而,橙皮苷给药后降低了组织和血清中的亚硝酸盐浓度,表明橙皮苷通过·NO自由基发挥清除作用,抑制炎症通路,从而发挥抗炎作用。这些影响也与先前关于橙皮苷的报道一致。其余参数包括总白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数以及渗出物中TNF-α的浓度以及组织学特点没有发生明显变化。然而,目前关于橙皮苷对MSC的软骨形成过程中免疫应答的影响尚无研究报道。目的:在本研究中,通过两次冷冻干燥过程以BDDE作为交联剂的方法制备CHA支架,并测定了支架的物理化学性质,通过建立微骨折手术的全层软骨缺损小型猪模型,评估支架对促进软骨修复的影响;进一步通过分离出人类MSCs,研究橙皮苷对MSCs软骨组织修复过程中软骨形成的影响,探讨软骨修复过程中的可能机制。该研究将为CHA支架在软骨工程领域的应用奠定基础。方法:该研究包括三个连续的部分,实验过程如下:第一部分修饰玻璃酸钠制备组织工程软骨支架材料及其理化性质的实验研究1.1CHA支架的制备分别称量分子量(Mw)为1850kDa和350kDa的两种SH,并以1:1的比例混合。然后加入含有交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)的0.2%NaOH溶液并搅拌该溶液。将均匀的凝胶倒入具有光滑且不透水表面的模具中,加入量为0.2ml/cm2。将模具放入冷冻干燥机并冷冻干燥。将冷冻干燥的样品转移到培养箱中,加热4小时,然后浸入温度为70±2℃的蒸馏水中以促进肿胀。将溶胀的样品再次冻干,将最终的冻干样品在室温下保存在干燥器中进一步测试。1.2 CHA支架物理化学性质的检测在最佳条件下制备CHA支架样品进行形态学研究,使用SEM在5kV加速电压和10mm工作距离处表征CHA支架的表面和横截面形态。为了获得膨胀的样品,将CHA支架切成5mm×5mm的小片,在蒸馏水中浸泡24小时达到平衡,在-35℃下速冻并冻干。然后将样品喷涂并用金涂覆20秒,并装载在铝短棒上进行SEM成像。然后使用配备有彩色照像机的光学显微镜来研究溶胀样品的形态。将溶胀的支架的干燥样品置于清洁的载玻片上,分别在透射光和反射光下测量光学图像。检测CHA支架的其他物理化学性质:包括CHA支架的修饰程度;干燥样品和湿样品的抗压强度;吸水率;扩张率;和孔隙率。第二部分修饰玻璃酸钠组织工程软骨支架在猪软骨缺损动物模型的应用研究2.1建立全层软骨缺损的动物模型本研究使用的动物为12只普通小型猪,体重20±2 kg,年龄4～5个月,由上海南汇老港华兴特种动物饲养中心提供。将实验动物成功麻醉后,固定并常规消毒/铺无菌巾单。在左右肢膝盖上切开2至3厘米(cm)的皮肤切口以露出关节。在股骨髁上制作5.0mm直径的圆柱形软骨缺损。孔之间的距离约为2～3 mm,深度约为3～4 mm。在手术过程中,仔细清理软骨下骨,以避免出血,并确保每个缺损的大小基本相同。手术后,用CHA支架植入右膝,然后恢复关节的正常结构并闭合伤口。同时左膝关节充当对照,只通过外科手术恢复结构并闭合伤口。2.2 CHA支架植入覆盖动物的右膝关节处软骨缺损,在缺损底部和缺损软骨边缘周围涂上薄层纤维蛋白胶(参见产品使用说明)。然后将CHA支架植入缺损部位,用盐水滴润湿,同时用手术刀柄轻轻按压,完成粘合剂的固定。用软组织覆盖缺损部位,复位髌骨,屈曲膝关节将进一步压实植入物。然后打开软组织,脱位髌骨,检查种植体和缺损粘连的边缘,最后进行关节修复和缝合。允许动物自由活动后,使用标准动物饲料和清洁饮用水,室温保持在15-26℃,每日紫外线消毒和术后肌肉注射青霉素,每天早上和下午5万单位,以防止术后感染。2.3术后观察手术后7天内每天进行一次笼外观察,每周一次,详细记录体征、行为活动、流涎、呼吸状况、排尿和切口的局部反应情况。2.4血液学检查在手术后6个月和12个月从动物的静脉采集血样。以3500r/min离心15min,然后使用Hitachi 7180自动生化分析仪进行血清生化检测。2.5病理检查肉眼观察:术后6个月、12个月时,分别取3只动物经1%戊巴比妥钠溶液麻醉后,颈总动脉切开放血处死后取下整个后腿,露出膝关节,大体观察缺损修复情况,包括缺损修复程度,表面平整度,颜色改变;与周围正常软骨的整合情况,边界是否清楚,有无裂隙。关节滑膜是否增生。组织切片:切取以缺损为中心的1.5 cm的修复的软骨表面组织及软骨下骨,采用10%中性福尔马林固24 h以上,10%EDTA脱钙液脱钙30 d,隔日更换脱钙液,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡,纵向石蜡包埋。5 um切片,按传统方法分别进行染色和番红-O染色,并根据文献进行O' Driscoll关节软骨组织学评分。2.6生物力学测试将-80℃冷冻保存的缺损修复软骨及正常软骨样品取出,在常温下解冻后进行压痕测试,测量软骨组织的杨氏模量(MPa),应力松弛时间(s)和蠕变时间(s)。2.7Ⅱ型胶原蛋白检测用直径6 mm的环钻将做完力学测试的软骨修复组织完全切下,同时切下等量的健康软骨组织,切取小部分组织用于Ⅱ型胶原定量测定,剩余部分用于糖氨多糖(GAG)含量的测定。将软骨样品称重,冻干后再确定干重,以确定每毫克组织湿重及干组织中胶原蛋白含量。然后,通过胃蛋白酶消化所获得的沉淀物,直到几乎所有组织碎片都溶解。之后,根据猪胶原蛋白Ⅱ(ColⅡ)Elisa试剂盒的程序,通过ELISA试验检测胶原蛋白含量。2.8糖氨多糖(GAG)含量测定取新鲜的软骨样品称湿重,样品冻干后,称取干重。然后将冻干组织切成小块,于95%酒精中浸泡2-3 h,再移入丙酮液中浸泡2 h,用滤纸包好,在索氏抽脂器中脱脂16 h。将脱脂的样品置80℃干燥4h,粉碎至细粉末状。经酶解沉淀冷冻干燥,即为GAG粗制品。根据猪GAG检测试剂盒Porcineglycosaminoglycan(GAG)Elisa Kit说明书描述的测定方法,测定样品GAG的含量。第三部分促进组织工程软骨支架进行软骨修复的方法和机制研究3.1人类MSC的分离和培养经山东大学第二医院委员会批准人体细胞使用方案,获得所有患者的书面同意书,从山东大学第二医院患者的术后废弃骨组织中采集骨髓细胞。3.2菌落形成试验将总共100个MSC接种到10cm培养皿中并连续培养长达21天。使用结晶紫(0.5%,SIGMA,MO,USA)将形成的菌落染色15分钟,然后在光学显微镜下计数。计数直径大于2mm的菌落。3.3增殖试验通过商业CCK-8试剂盒评估细胞增殖。简而言之,将MSC接种到6孔板中,然后进行各种处理。向每个孔中加入10μlCCK-8溶液,显色反应在37℃下进行15分钟。使用酶标仪记录450nm处的吸收并计算相对细胞存活率。3.4软骨形成测定将MSC在软骨诱导培养基(DMEM,0.2mM抗坏血酸2-磷酸,20%FBS和10mM甘油2-磷酸)中培养14天,每2天更换新鲜培养基。使用Alcian Blue(Millipore,Billerica,MA,USA)染色评估软骨形成。3.5 mRNA提取和实时PCR使用Trizol提取总mRNA,并按照制造商的说明书用SuperscriptII逆转录成互补cDNA,通过real-time PCR在以下条件下进行重复三次的PCR反应:95℃下15秒,60℃下1分钟40次。使用GAPDH作为内参计算相对表达水平。3.6 Western Blot蛋白质印迹在含有 150mMNaCl,50mMTris-HCl,1OmMHEPES,0.1%NP-40 替代物,0.5mMNaF,0.25%Na-脱氧胆酸盐,1mMNa3VO4,pH7.4(蛋白酶抑制剂混合物)的裂解缓冲液中制备细胞再悬浮液。使用BCA蛋白质测定法定量细胞裂解物,然后在SDS-PAGE上运行30μg总蛋白质,然后转移至PVDF膜。随后用1%BSA(牛血清白蛋白)封闭膜,并与一抗4℃孵育过夜。利用HRP缀合的二抗来显现基于ECL成像系统中的条带。3.7酶联免疫吸附试验(ELISA)通过离心完全除去MSC,收集透明培养基用于ELISA分析。使用市售ELISA试剂盒,按照制造商的说明书测量IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的水平。4统计分析使用SPSS22.0系统(IBM,Armonk,NY,USA)分析所有数据,并以平均值土标准偏差(SD)表示。组间差异由学生T检验和单因素方差分析(ANOVA)确定。P值小于0.05被认为具有统计学差异。结果1 CHA支架的物理化学性质物理化学性质的检测表明,CHA支架是一种多孔的海绵状外观,在SEM下孔径为80-150 μm(图1,图2)。如表2所示,CHA支架的修饰程度为(3.10±0.27)%。干燥样品的压缩强度为(14.80±4.06)kPas,湿样品的压缩强度为(0.5762±0.11)kPas(图 3);吸水率为(58.6±3.5)%,膨胀率为(100.7±4.8)%,孔隙率为(96.5±2.6)%。2.1常规术后观察结果手术后3-5小时,动物基本上从麻醉中恢复。24小时后,动物可以站立,左后肢跛行,食物摄入量和饮用水基本正常。术后15天内,手术部位几乎完全恢复,皮毛发亮。同时,眼睛、鼻子和耳朵周围没有明显分泌物,亦并未发现其他身体部位的创伤和炎症。此外,他们的行为和步态几乎正常,未发现明显的临床不良反应。2.2术后血液学检查术后6个月和12个月评估血液学指标,以明确手术和CHA支架植入对动物机体的整体影响。结果发现,如表3所示,除了个别生化离子和脂质因子外,CHA支架植入组与对照组相比,常规血液检查、肝肾功能检查和生化离子检测以及凝血指标等的大部分结果两组间并无显著差异。更重要的是,在所有研究动物中测得的这些常规血液学因素均在正常的生理波动范围内。2.3病理特征动物膝关节的缺损软骨于术后6个月开始修复,在肉眼观察下可发现,修复逐渐从中央到周围展开。如图1所示,我们发现6个月后CHA支架植入组基本修复了软骨缺损,缺损区与修复区的交界处清晰而紧密,没有裂缝,但修复区域与正常软骨相比略显苍白。然而,对照组缺损区的修复表面是断断续续不规则状,缺损区与修复区域的连接处亦不清楚。于术后12个月时进一步观察发现,CHA支架植入组膝关节修复区软骨表面光滑,颜色与正常软骨相似。修复区域的边缘基本上与正常软骨合并。正常区域和修复区域之间没有明显的界限,与6个月相比,修复程度明显提高。而对照组手术后12个月的软骨表面和边缘与6个月时的观察结果没有显著改善。此外,对手术后6个月和12个月获得的组织进行HE染色,显微镜下进一步观察,结果显示在CHA植入组的动物的软骨表面上可见一些软骨细胞。同时,HE染色显示软骨周围有深蓝色细胞核和红色基质,提示修复了不同程度的纤维组织(图2)。通过番红O染色,我们发现植入组的修复软骨组织的浅层甚至深层在6个月后呈现出轻度、不均匀染色,而对照组的染色则更浅,更加不均匀。此外,植入组修复区域的基质在术后12个月时染色更深,但在对照组中,只有浅层软骨甚至中间层有轻微染色,而且染色呈现不均匀。(图2)根据O'Driscoll关节软骨组织学评分标准,进一步评估了软骨修复后的主要的组织学类型、结构特征、细胞变性和相邻软骨的退行性变化。左右膝关节软骨修复综合评分结果如表4所示,植入组细胞变性和邻近软骨退变均高于对照组,术后6个月和12个月结果一致,提示CHA支架可以减少损伤引起的软骨退变,并可能促进软骨缺损的修复能力。2.4修复软骨的生物力学特性通过杨氏模量、应力松弛时间和蠕变时间评估生物力学性能,其测试在手术后6个月和12个月进行。如表5所示,术后6个月和12个月的杨氏模量、应力松弛时间和蠕变时间所反映的生物力学性能组间存在显著差异。植入支架修复区域的测量值高于对照组修复区域(图3),更接近正常区域软骨的测量值,表明CHA支架软骨的植入在修复软骨的生物力学性能方面优于手术组。用CHA支架基质植入有利于促进软骨修复并提高其压缩能力。2.5 Ⅱ型胶原蛋白表达如表6所示,组间修复的软骨中Ⅱ型胶原蛋白的表达存在差异。CHA支架植入组Ⅱ型胶原蛋白水平在6个月和12个月时均高于对照组,但两组在6个月时均显着低于正常软骨,而手术后12个月各组之间并未取得显著的统计学差异。我们的结果表明CHA有利于软骨组织中Ⅱ型胶原的积累。然而,软骨的修复在短时间内仍然与正常软骨不同。2.6糖胺聚糖表达为了明确修复的软骨水平,我们进一步评估了糖胺聚糖的表达情况。我们发现在术后6个月和12个月评估的GAG表达组间存在显著差异,GAG在修复的软骨中的表达低于正常软骨。此外,我们发现对照组软骨中GAG含量显著低于实验组(p0.05)。此外,在手术后6个月和12个月评估CHA支架植入组的GAG表达与正常组间没有显著差异。换句话说,植入CHA支架后修复的软骨中GAG的含量几乎达到正常水平(表7)。这表明CHA有利于刺激修复部位GAG的积累,并且GAG的积累随时间增加。3.1橙皮苷可改善MSCs的自我更新能力橙皮苷的化学结构如图1A所示。在实验中用不同剂量的橙皮苷(0,1,5和10 μM)作用于MSC细胞,并通过集落形成和增殖测定方法评估细胞自我更新能力。经橙皮苷处理后,集落的相对数量和平均大小均显着增加至5μM(图1B,C)。类似地,使用CCK-8测定的细胞活性的方法清楚地证明橙皮苷显著刺激细胞增殖(图1D)。然而,高剂量的橙皮苷(在我们的系统中为10 μM)产生了对集落形成和细胞增殖的轻微抑制(图1B,C,D)。因此,选择5μM的橙皮苷作为本研究中后续实验的最佳剂量,并且据我们所知,这些发现提供了橙皮苷改善患者来源的MSC的干细胞特性,即高增殖、低分化和自我更新能力的第一证据。3.2橙皮苷增强MSC的软骨形成能力接下来,我们试图评估橙皮苷对MSCs软骨形成能力的可能影响。在橙皮苷处理后,在MSC中诱导软骨形成14天。如图2A所示,AlcianBlμe染色显示橙皮苷处理的MSC中的软骨形成显著增加。通过测量特异性软骨形成标记物Sox9在分子水平上进一步证实了这些表型观察,其中橙皮苷处理诱导了 Sox-9的明显上调(图2B)。我们的研究结果清楚地表明,除了自我更新能力,橙皮苷还能增强MSCs的软骨形成能力。3.3橙皮苷抑制促炎细胞因子的分泌促炎细胞因子是先天和后天免疫反应的重要参与者。因此,我们在不使用或使用5μM橙皮苷的情况下分别对MSC进行处理,然后使用ELISA测量培养基中促炎细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的水平。结果清楚地表明,与对照相比,橙皮苷处理抑制了所有上述细胞因子的分泌(图3)。3.4橙皮苷抑制核因子κB(NF-κB)亚基p65的表达为了确定炎症的程度,我们检查了炎症反应中生物标志物的表达,例如NF-κB亚基p65。我们在不使用或使用5μM橙皮苷的情况下分别处理MSC,然后检查对p65表达的影响。我们发现橙皮苷处理显着降低了p65的mRNA和蛋白水平(图4A和4B),表明橙皮苷能够抑制NF-κB亚基p65的表达。3.5 p65是橙皮苷抑制细胞因子分泌和增强软骨形成所必需的然后我们进一步探讨橙皮苷对p65的抑制作用是否与先前观察到橙皮苷对细胞因子分泌的抑制作用相关。为此,我们在MSC中过表达p65,并证实p65的mRNA和蛋白质水平都大大提高(图5A和5B)。过表达p65能够逆转橙皮苷抑制促炎细胞因子IFN-y,IL-2,IL-4和IL-10的分泌(图6),表明p65确实是抑制橙皮苷对MSC细胞因子分泌的必要条件。用针对NF-κB亚基p65的siRNA或空白对照转导MSC,然后评估mRNA和p65的蛋白质表达,基质中IFN-y、IL-2、IL-4和IL-10的水平。将转染p65siRNA或空白对照的MSC进行14天的分化诱导,然后评估软骨形成标记物Sox9的mRNA表达,和软骨形成程度。结果证实p65敲除可抑制IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌,并增强MSC的软骨形成(图8)。接下来,我们进一步研究了p65对橙皮苷增强软骨形成的作用。在不存在(对照)或存在5 μM橙皮苷的情况下,在软骨形成诱导后第14天,用空载体对照或p65质粒转染MSC。p65的过表达能够逆转橙皮苷在阿尔新蓝染色(图7A)和Sox9表达(图7B)方面的增强作用,表明p65也是增强橙皮苷对MSC软骨形成所必需的。结论总而言之,CHA支架对软骨修复的影响表明它可能有助于促进缺损软骨的修复,CHA支架植入物可以促进软骨修复的关节修复。CHA支架的植入可以在一定程度上提高修复软骨的抗压缩能力。本研究初步证明了CHA支架在微骨折中的植入有利于软骨的修复和减少损伤引起的软骨退行性变化,但更多的动物仍需要进一步检测以验证其软骨修复效果。当应用于微骨折手术时,CHA支架可以促进软骨修复,并且有望用于软骨组织工程领域。我们目前的研究表明,橙皮苷可作为治疗剂,通过抑制炎症促进软骨组织修复,有效增强人MSCs的软骨形成。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68;R318.08
【图文】：

形态图,形态,支架,透射光

CHA支架的SEM形态

形态图,形态,透射光,反射光

光学显微镜检查CHA的形态

【参考文献】