靶向抑制Id1联合BMP9对骨肉瘤细胞成骨分化作用及相关机制研究

发布时间：2020-07-06 10:47

【摘要】：第一部分靶向抑制Id1基因对骨肉瘤细胞相关生物学行为及成骨分化影响目的:通过抑制分化抑制因子1(Id1)的表达探讨其对骨肉瘤细胞生物学行为及成骨分化的影响及相关机制。方法:(1)运用重组腺病毒Ad-si Id1处理骨肉瘤细胞MG63,重组腺病毒Ad-RFP作为腺病毒对照组,未用任何病毒处理的MG63作为空白对照组,调控骨肉瘤细胞MG63中Id1的表达水平;(2)运用半定量RT-PCR和western blot技术分别在m RNA水平及蛋白水平确定重组腺病毒Ad-si Id1及Ad-RFP对骨肉瘤细胞MG63细胞的调控效果;(3)运用Annexin V-FITC单染法及DAPI染色法检测不同处理后骨肉瘤细胞凋亡情况,FCM法检测对细胞周期分布的影响;(4)运用ALP染色及茜素红S染色检测调控Id1表达后骨肉瘤细胞成骨分化能力;(5)运用western blot技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Survivin以及Wnt信号通路关键蛋白β-catenin、ROR2和CHOP蛋白的表达水平。结果:(1)重组腺病毒Ad-si Id1感染MG63细胞后,Id1在m RNA及蛋白表达水平较对照组均下降(差异有统计学意义,p0.05);(2)沉默Id1后骨肉瘤细胞凋亡率较对照组提高(差异有统计学意义,p0.05);(3)沉默Id1后可促进骨肉瘤早期成骨分化,对晚期成骨分化无作用;(4)沉默Id1后抗凋亡因子Bcl-2及Survivin表达较对照组均下调(差异有统计学意义,p0.05);(5)沉默Id1后Wnt信号通路关键蛋白β-catenin、ROR2和CHOP蛋白的表达水平均下调(差异有统计学意义,p0.05)。结论:重组腺病毒Ad-si Id1可以抑制骨肉瘤MG63细胞Id1表达;抑制Id1基因的表达可促进骨肉瘤细胞凋亡,同时抑制抗凋亡相关基因Bcl-2和Survivin的表达;抑制Id1的表达可以促进骨肉瘤早期成骨分化,不能促进晚期成骨分化,其作用可能与抑制Wnt信号通路相关基因表达有关。第二部分靶向抑制Id1联合BMP9对骨肉瘤细胞成骨分化作用目的:在体外及体内水平探讨抑制分化抑制因子1(Id1)联合BMP9对骨肉瘤细胞成骨分化的作用及其机制,为骨肉瘤的靶向治疗提供相关依据。方法:(1)运用重组腺病毒Ad-si Id1、Ad-BMP9分别及联合处理骨肉瘤细胞MG63,重组腺病毒Ad-RFP作为腺病毒对照,诱导其成骨分化;(2)应用western blot技术在蛋白水平比较重组腺病毒Ad-si Id1、Ad-BMP9及Ad-RFP对骨肉瘤细胞MG63细胞的调控效果;(3)在体外实验中应用碱性磷酸酶染色(ALP)及读数法检测骨肉瘤早期成骨分化,通过western blot技术检测中晚期成骨分化指标OPN的表达,并用钙盐沉积实验检测晚期成骨分化指标;(4)在体内实验中,采用原位成瘤法,运用体外活体成像技术观察肿瘤大小及远处转移情况,运用HE染色,masson染色观察体内成瘤组织成骨分化程度;(5)通过重组腺病毒技术调控骨肉瘤细胞MG63中Id1、BMP9的表达水平后,分别在24 h和48 h运用western Blot技术在蛋白水平检测相关信号通路蛋白表达情况。结果:(1)Ad-BMP9较对照组可增加细胞内BMP9表达量(差异有统计学意义,p0.05),BMP9+si Id1组与BMP9组相比BMP9表达量无差异;si Id1组Id1表达较其他组降低(差异有统计学意义,p0.05);BMP9+si Id1组的Id1表达均较其他组高(差异有统计学意义,p0.05),BMP9组和对照组相比Id1的表达量并无差异;(2)通过重组腺病毒过表达BMP9或抑制Id1表达后骨肉瘤细胞ALP的活性及ALP染色相对于对照组增高(差异有统计学差异,p0.05);靶向抑制Id1联合BMP9相对其他实验组可有效地促进骨肉瘤细胞MG63碱性磷酸酶活性及ALP染色(差异有统计学意义,p0.05);(3)中晚期成骨分化指标OPN表达在感染Ad-BMP9后均增高(高于对照组与si Id1组),抑制Id1后OPN的表达也比对照组高,且靶向抑制Id1联合BMP9组OPN的表达量最高(差异有统计学意义,P0.05);(4)对于晚期成骨分化指标茜素红S染色,si Id1组和RFP组无钙盐沉积,BMP9组有少许钙盐沉积,但靶向抑制Id1联合BMP9组的钙沉积最明显;(5)体内实验中各组均成瘤,且均未检测到远处转移,瘤体大小无统计学差异;HE染色及Masson染色结果显示对照组无成骨分化能力,单独抑制Id1或增强BMP9表达虽可以促进骨肉瘤分化,但两者联合后成骨分化能力最强。(6)对于AKT信号通路而言,成骨分化最强的一组即BMP9+si Id1组,p-AKT的表达并不是最强的,成骨分化能力较弱的BMP9组其p-AKT的表达在24 h及48 h均表达最高(差异有统计学意义,p0.01),而同样并无成骨分化能力的si Id1组p-AKT的表达在24 h时与空白对照组无明显差异,在48 h较对照组增高(差异有统计学意义,p0.01);(7)对于经典Wnt信号通路关键因子β-catenin而言,24 h时,BMP9组与si Id1组的表达均低于BMP9+si Id1组与对照组(差异有统计学意义,p0.01);48 h时BMP9表达最高(差异有统计学意义,p0.01),si Id1组较BMP9+si Id1组表达降低(差异有统计学意义,p0.01),成骨分化能力最强的联合组较BMP9组β-catenin表达低,较空白对照组表达高(差异有统计学意义,p0.01);(8)GSK-3β作为wnt信号通路的负向调控因子,其趋势与β-catenin相反;在24 h时BMP9组表达最高,空白组最低;在48 h时虽然si Id1组的表达与BMP9+si Id1组无明显差异,但在24 h时si Id1组的表达较低。结论:(1)体外实验中靶向抑制Id1联合BMP9的ALP染色及读数增强,OPN蛋白水平表达上调,钙盐沉积也增强;单独过表达BMP9后对骨肉瘤早期、中晚期成骨分化能力较弱;单独抑制Id1的表达只可促进骨肉瘤细胞早期成骨分化指标ALP的增加;表明两者促成骨分化作用均较靶向抑制Id1联合BMP9弱;(2)体内实验中裸鼠成瘤大小并无明显差异,均未发现远处转移,而靶向抑制Id1联合BMP9组骨样基质增加;这些结果表明抑制Id1联合BMP9可促进骨肉瘤细胞MG63成骨分化;(3)通过检测相关信号通路关键因子的表达,成骨分化能力最强的BMP9+si Id1组的p-AKT、GSK-3β表达在24 h较BMP9组低,较RFP组高,β-catenin表达在24 h较RFP组低,si Id1组高;BMP9+si Id1组的p-AKT、β-catenin表达在48 h较BMP9组低,较RFP组高,GSK-3β表达在48 h较BMP9组高,较RFP组低。说明骨肉瘤成骨分化是通过各种信号通路共同参与形成的平衡过程的过程,单一信号通路的抑制或者增加并不能对其产生作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738
【图文】：

蛋白质印迹法,重组腺病毒,细胞,表达水平

重庆医科大学硕士研究生学位论文30图1 分别采用半定量RT-PCR法和蛋白质印迹法检测重组腺病毒AdsiId1转入MG63 细胞后对 Id1 mRNA（A）及蛋白（B）表达水平的影响。(A)通过半定量 RT-PCR 在 mRNA 水平检测 MG63 在感染 Ad-siId1、Ad-RFP72 h 后 Id1 的表达水平。（B）Western blot 在蛋白水平检测 Id1 的表达。（Blank 组：MG63 细胞未做任何处理；AdRFP 组：重组腺病毒 Ad-RFP 感染的 MG63 细胞；AdsiId1 组：重组腺病毒 Ad-siId1 感染的 MG63 细胞）。β-actin 作为内参。Fig.1 (A)The expression levels of Id1 mRNAs in MG63 cells 72 h after infection withrecombinant adenoviruses Ad-RFP, Ad-siId1 were detected by semi-quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction (RT-PCR).(B)The expression levels of Id1 protein inMG63 cells was deteced by Western blot.(Blank group: MG63 cells were not treated ; AdRFPgroup: MG63 cells were infected with adenovirus AdRFP; AdsiId1 group: MG63 cells wereinfected with Ad-siId1).β-actin was used as the internal control*P<0.05, vs the negativecontrol group (blank group and AdRFP group)(n=3).3.2 沉默 Id1 基因表达对 MG63 细胞凋亡率的影响Ad-RFP 和 Ad-siId1 转入 MG63 细胞 72 h 后，FCM 法检测结果（图 2A）显示，

基因表达,细胞凋亡,凋亡,学位论文

重庆医科大学硕士研究生学位论文AdsiId1 组的凋亡率为（20.1±0.12）%，明显高于 AdRFP 组的（8.89±0.09）% 和空白对照组的（9.31±0.10）%（P 均＜ 0.05）。DAPI 染色法检测结果（图 2B）显示，AdsiId 组发生凋亡的细胞数明显高于空白对照组和 AdRFP 组（P 均＜0.05）。上述结果提示，沉默 Id1 基因表达可以促进骨肉瘤细胞 MG63 的凋亡。

细胞周期,基因表达,学位论文,医科大学

重庆医科大学硕士研究生学位论文FCM 法检测结果（图 3）显示，AdsiId1 组细胞中 G1 期细胞占细胞总数的百分比为（87.05±1.17）%，明显高于 AdRFP 组的（41.48±2.25）%及空白对照组的（32.37±2.17）%（P 值均＜0.05）。这一结果提示，抑制 Id1 的表达可以抑制骨肉瘤细胞由 G1 期进入 S 期，从而抑制细胞增殖。

【参考文献】