生物活性镁涂层修饰多孔Ti6Al4V支架成骨及血管化效应研究

发布时间：2020-07-10 09:30

【摘要】：研究背景:近年来,多孔钛合金支架由于具有显著的机械性能,较少的应力屏蔽和较好的促进新骨生长作用已受到相当大的关注。具有可控几何形状,孔径大小和孔隙率的多孔钛合金支架是用于骨替代修复的首选材料。支架材料在植入后从周围组织血管中得到营养和氧气供应对于支架材料的存活和成骨至关重要。新的血管形成对于支架的存活并发挥功能是必需的。关于多孔钛合金表面修饰的研究已有相当多年的发展,相关的报道也有很多.通过对多孔钛合金进行表面生物学改性来提高其活性,但是依然存在着骨生长不足,而且对于血管化这个支架材料存活至关重要的指标研究报道很少。骨生长不足和缺乏血管化向内生长进入多孔钛合金支架限制了它们的进一步应用。因此,具有骨生成和血管生成特性的生物功能涂层对于多孔钛合金支架长期固定和存活以及其临床应用至关重要。镁金属是一种可降解金属材料,镁离子在人体骨代谢中扮演着重要的角色。近年来大量的研究报道,镁基合金与钛合金相比具有更好的生物学活性,在骨折修复和骨缺损重建中可以促进新骨生长。但由于镁基合金容易发生腐蚀效应导致快速降解,降解后出现力学支撑不足等缺点,限制了镁基合金作为移植材料在骨科中的应用。近年来,关于如何提高镁合金材料耐腐蚀性的研究报道有很多,但是直接将镁金属作为生物可降解涂层制备于钛合金材料表面的研究尚未发现。镁金属涂层的生物活性、成骨效应和血管化能力都有待于进一步探索和研究。方法:1.应用电子束熔融技术(EBM)制备多孔Ti6Al4V支架材料,采用脉冲偏压电弧离子镀技术在多孔Ti6Al4V支架材料内、外表面制备镁金属涂层。扫描电镜观察多孔Ti6Al4V支架材料表面及孔隙内部涂层形态,能谱分析检测其元素组成。2.利用小鼠成骨前体细胞系(MC3T3-E1)来进行多孔Ti6Al4V支架材料体外成骨活性的研究。利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)来检测支架材料的体外促血管化活性。将MC3T3-E1和HUVEC两种细胞分别与生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料的浸提液共同培养,检测细胞生物相容性。利用alamar Blue比色测定法检测MC3T3-E1和HUVEC两种细胞的增殖情况;Calcein-AM/PI双染色试剂盒检测两种细胞的活力。通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察两种细胞在不同浸提液培养下的黏附、伸展状况。通过碱性磷酸酶染色,茜素红钙结节染色,实时定量PCR来检测生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料的浸提液对于MC3T3-E1的成骨促进作用。通过划痕试验,Transwell试验,成管试验,实时定量PCR来检测生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料的浸提液对于HUVEC血管化的促进作用。3.体内实验取成年新西兰大白兔42只,采用新西兰大白兔的股骨髁部骨缺损模型来评价生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料的长期成骨性能以及早期血管化性能。选择在术后第6、9、12个月进行影像学和组织学染色等方法进行支架材料长期成骨效果的分析。由于钙黄绿素、茜素红和四环素在实验动物体内无法长时间留存,会出现荧光衰减现象,故采用术后12周时间点进行荧光标记实验研究。而对于早期血管化研究,选择在术后第2、4、8周进行微血管造影,显微CT等方法进行分析。结果:1.扫描电镜发现规则、均匀、致密的镁金属晶粒分布在多孔Ti6Al4V支架材料的内外表面,与材料表面结合良好,能谱分析结果显示单相镁涂层存在于材料表面;2.Alamar Blue比色测定法结果表明:相较于单纯多孔Ti6Al4V支架材料,生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料在细胞培养第4、7、14天时可以促进MC3T3-E1细胞和HUVEC细胞的增殖(p0.05);CLSM结果显示与生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料浸提液共培养的MC3T3-E1细胞和HUVEC细胞黏着斑蛋白的表达量出现明显的增加,且细胞总面积/细胞核面积比例明显增加(p0.05);生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料浸提液可以促进MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性和细胞外基质矿化及钙结节的形成;生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料浸提液可以促进HUVEC细胞的迁移、侵袭及小管形成能力;实时定量PCR结果表明,生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料浸提液可以促进成骨相关基因ALP、Col-1、OPN、OCN和成血管相关基因VEGF、HIF-1α的表达;3.Micro-CT结果显示与单纯多孔Ti6Al4V支架材料相比,在第6、9、12月时生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料组BV/TV明显增高(p0.05);骨组织荧光三标结果显示生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料组在12周时具有更高的荧光标记强度;组织学VG染色结果显示,在6、9、12月时生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料组BV/TV明显增高(p0.05),且骨组织与支架的整合效果更佳;微血管灌注造影发现,植入后2周,生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料组的BVV/TV值(21.2±3.2%)显著高于单纯多孔Ti6Al4V支架材料组(10.9±1.8%,p0.05)。4周时,生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料组的BVV/TV值为35.3±4.5%,明显高于单纯多孔Ti6Al4V支架材料组(15.5±3.4%,p0.05)。植入8周后观察到类似的结果。结论:1.利用扫描电镜和X射线能谱分析观察验证成功的制备出了具有优良孔隙率、孔径等参数的多孔Ti6Al4V支架材料,并在多孔Ti6Al4V支架材料表面成功利用多弧离子镀的方法制备出了结合紧密的高纯度镁金属涂层。2.体外实验研究证实生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料可以在体外促进MC3T3-E1细胞和HUVEC细胞的增殖、黏附、伸展;促进HUVEC细胞的迁移、侵袭以及小管形成;促进MC3T3-E1细胞成骨分化和HUVEC细胞的血管化。3.通过体内研究证实生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料具备良好的促进新骨生成能力,并且有利于骨组织与支架材料的整合。同时,生物活性镁涂层修饰的多孔Ti6Al4V支架材料促进了周围组织的早期血管化,为支架材料内部的新骨生成提供了充分的营养。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08;R68
【图文】：

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一、骨缺损修复的研究进展骨的结构遭到物理性或者化学性的破坏，使骨结构失去了完整性形成骨缺损。正常骨组织的结构如图 1 所示。导致骨缺损的原因通常有车祸、战争、工作性切割损伤等外部原因和骨髓炎、结核、骨肿瘤、各种骨组织先天性遗传性疾病等内部原因导致[1]。由于骨组织具有强大的自我修复能力，对于小的骨缺损而言，可以通过骨组织自我修复功能进行修复，但对于大的缺损超过机体骨组织自我修复能力时往往需要通过骨移植术来进行修复[2]。骨缺损的治疗一直以来是一个长久困扰临床医生和研究人员的难题，往往难以取得满意的效果，给病人本身及家庭和社会都会带来沉重的身体心理压力和经济压力。临床上目前对于骨缺损的治疗方法主要有三大类，第一类是自体骨移植术[3-6]；第二类是同种异体骨移植术[7-10]；第三类是人工骨替代材料[11-13]。

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可以较为有效的缓解由于弹性模量不匹配导致的应力遮挡效应，有利于植入后的骨修复和重建。但是表相多孔钛合金存在一些问题，由于表面的多孔结构主要通过烧结等方法制备，与内部钛合金实体部分结构的结合界面容易出现断裂，并导致植入的支架材料出现松动，容易导致植入手术的失败。体相多孔钛合金的均匀孔隙从内到外贯穿整个支架材料，避免了表相多孔钛合金由于存在受力不均匀导致的支架植入材料结合界面结构出现断裂的情况。体相多孔钛合金材料内外表面大量相互连通的孔隙结构可以为成骨细胞向内部迁移、增殖提供良好的孔道结构，有利于支架材料内部营养物质和氧气的自由流通和交换。多孔钛合金的孔隙长入新生骨组织后形成机械锁固结构，增强了多孔钛合金植入体与周围骨组织的结合强度，可以获得较好的长期稳定性。通过调整体相多孔钛合金的参数，调整材料孔隙率、孔径大小可以获得符合特定要求的具有特定弹性模量和力学强度等参数的多孔钛合金支架材料，满足不同植入要求。因此，体相多孔钛合金是目前比较理想的移植物修复材料。

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图 3.多孔钛合金结构的设计，增材制造的示意图[15, 57]与 EBM 应用电子束作为能源不同，SLM 技术使用波长可调的激光束作为将钛金属粉末融化来制备多孔钛合金支架材料。在计算机的辅助下，可以制备出仿生骨小梁形态结构的多孔钛合金支架材料，具备良好的生物相容性。通过 SL以制备出特定孔隙率和孔径的多孔钛合金支架材料。但是由于 SLM 使用激光束能源，能量密度不足，融化金属粉末来制备多孔钛合金速度较慢。EBM 具有更扩散能量（较大的热影响区域），EBM 制造过程可制备出具有较小特征尺寸，中小的粉末颗粒、层厚度、分辨率和表面光洁度的支架材料。EBM 技术是近年来新兴的先进金属快速成型制造技术，通过电子束所产生的高能量融化金属粉末，融化的金属粉末凝固形成金属网状结构。随后在形成的金属网状结构上继续制二层金属网状结构，金属网状结构层与层之间相互融合、连接。如此层层累积，制备出完整的多孔钛合金支架材料。与传统的工艺相比，EBM 不受内外部复杂

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