ASPP2对恶性脊柱肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

发布时间：2020-07-19 00:39

【摘要】：目的:恶性脊柱肿瘤具有进展迅速的特点,能够破坏脊柱或其他组织,进而向周边器官转移,其手术难度高,易复发,预后差,因而严重影响患者的生活质量和生存周期。p53凋亡影响蛋白是p53结合蛋白家族中促凋亡蛋白的一员,能通过调节p53途径来增强凋亡活性。过去的研究发现ASPP2在肿瘤发生和进展过程中起着关键作用,然而ASPP2对恶性脊柱肿瘤细胞的作用机制还没有被阐明。材料与方法:我们收集了恶性脊柱肿瘤组织及邻近组织,分别用实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)对ASPP2基因的mRNA和蛋白表达水平进行了检测。此外,我分析了患者临床病理资料与ASPP2表达关系,并根据患者随访资料绘制生存曲线。我们用ASPP2过表达质粒来转染肿瘤细胞;运用MTT实验来检测肿瘤细胞的增殖速率;用蛋白免疫印迹检测了 p53的表达水平;通过对Caspase 3活性的测定来评价其对细胞凋亡的影响;使用流式细胞术来检测肿瘤细胞凋亡;用实时定量PCR来检测Bcl-2和Bax的基因表达变化。结果:在恶性脊柱肿瘤组织中,ASPP2基因的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05);此外,患者临床病理资料与ASPP2表达关系显示ASPP2表达与肿瘤大小、肿瘤分期呈负相关;根据患者随访资料绘制生存曲线,结果显示患者生存期与ASPP2表达正相关。在肿瘤细胞中转染过表达ASPP2的质粒,能够使肿瘤细胞凋亡比例增加,抑制其增殖,同时伴随着Bcl-2表达降低,Bax表达升高,以及Caspase 3和p53更高的活性,裸鼠成瘤实验也证明ASPP2过表达细胞增殖能力受到抑制。结论:ASPP2基因在恶性脊柱肿瘤组织中表达下调;ASPP2可以通过调节p53表达来促进细胞凋亡,并抑制恶性脊柱肿瘤细胞的增殖,因此可以作为肿瘤诊断和预后分析的一个分子靶标。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738
【图文】：

，当Ｐ＜０．０５时，则认为差别有显著性。逡逑果逡逑２在恶性脊柱肿瘤组织及癌旁组织中的ｍＲＮＡ达逡逑究报道，ＡＳＰＰ２在不同的肿瘤组织及癌旁组织中差异性表达。在恶性脊柱肿瘤组织及其癌旁组织中表达的差异性，我们从医院骨科获得恶性脊柱肿瘤组织及其癌旁组织各３０例（ｎ＝３０）ＰＣＲ检测ＡＳＰＰ２基因在肿瘤组织及其癌旁组织中的表达，组织比，肿瘤组织中ＡＳＰＰ２ｍＲＮＡ表达降低，Ｐ＜０．０５有统计＊逡逑

浓缩和定量后，得到质粒。将质粒，通过ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶，在３７°Ｃ水浴锅逡逑中条件下水浴，１．５ｈ后切^u，然后进行跑胶鉴定。结果显示：重组质粒酶切正逡逑确（图２．２）。构建的质粒送上海生工测序，结果显示：测序正确（图２．３）。逡逑Ｍａｋｅｒ邋１２逦３逦４逡逑图２．２酶切鉴定重组质粒逡逑（Ｍ：邋ＤＮＡＭａｋｅｒ；邋１、２、３、４：重组质粒邋ｐｃＤＮＡ３．１（－）－ＡＳＰＰ２）逡逑ｌｄｃｎ？ｔｙ＝邋９４．９５Ｘ逡逑１逦逦逦逦２３９５逡逑０逦１０逦２０逦３０逦４０逦５０逦６０逦７０逦８０逦９０逦１００逦１１０逦１２０逡逑ｌｌ？ｌｌｌｌｌｌ？ｌｌｌｌ匿ＭＩ｜■ｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌｌ？ＭＩＩＭｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌｌＭｌｌｌｌ｜ｌｌｌＭＩＩＭｌｌｒｒｒｌ＞ｔＭ事ｒｌｌｌｌｌＭ，ｌｌｌｌｌＭＩ？ｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌ■ｌ逡逑ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＴＧＣＧｍＵＣＧＧＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＣ＾ｔｔＷ＊Ｍｇｊｇ逡逑逦灥擺ｊ逡逑ａｔｇｔｃｃｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔｃｔｃｇａｔｇｃａａｃｔｃｔａｔｃｇｔｃａｃａｇｔｃａａｇａａ？？ａｔａａｇａｇａｃａｃａｔｇｇｃｔｇａｇｇｔｇａａｔｇｃａｔｃｃｃｃａｃｔｔ？逡逑图２．

逦３逡逑Ｂ１Ｂ逡逑图２．１左：从肿瘤细胞中提取到的人的总ＲＮＡ邋（邋１、２：人的总ＲＮＡ）；逡逑右：通过ＰＣＲ获得目的基因ＡＳＰＰ２（Ｍ：邋ＤＮＡＭａｋｅｒ；邋１．邋２、３：邋ＰＣＲ产物）逡逑２）酶切、连接并测序鉴定重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（－）－ＡＳＰＰ２重组质粒正确。逡逑ＰＣＲ产物使用胶回收试剂盒回收纯化，并以３：邋１的比例连接到ｐｃＤＮＡ３．１逡逑质粒上。连接反应在４°Ｃ进行１６个小时。剔１０９感受态细胞转化克隆质粒之后，逡逑用ＬＢ固体平板和ＬＢ液体培养基培养。提取得到的ｐｃＤＮＡ３．１－ＡＳＰＰ２，在经过逡逑浓缩和定量后，得到质粒。将质粒，通过ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶，在３７°Ｃ水浴锅逡逑中条件下水浴，１．５ｈ后切^u，然后进行跑胶鉴定。结果显示：重组质粒酶切正逡逑确（图２．２）。构建的质粒送上海生工测序，结果显示：测序正确（图２．３）。逡逑Ｍａｋｅｒ邋１２逦３逦４逡逑图２．２酶切鉴定重组质粒逡逑（Ｍ：邋ＤＮＡＭａｋｅｒ；邋１、２、３、４：重组质粒邋ｐｃＤＮＡ３．１（－）－ＡＳＰＰ２）逡逑ｌｄｃｎ？ｔｙ＝邋９４．９５Ｘ逡逑１逦逦逦逦２３９５逡逑０逦１０逦２０逦３０逦４０逦５０逦６０逦７０逦８０逦９０逦１００逦１１０逦１２０逡逑ｌｌ？ｌｌｌｌｌｌ？ｌｌｌｌ匿ＭＩ｜■ｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌｌ？ＭＩＩＭｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌｌＭｌｌｌｌ｜ｌｌｌＭＩＩＭｌｌｒｒｒｌ＞ｔＭ事ｒｌｌｌｌｌＭ

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本文编号：2761635