热敏水凝胶承载Nafamostat修复脊髓损伤的实验研究

发布时间：2020-07-22 21:40

【摘要】：【目的】本研究旨在探讨一种自主研发、药物缓释性良好的Nafamostat/PLGA-PEG-PLGA载药热敏水凝胶修复脊髓损伤的有效性。通过测定其性质,分析其生物相容性,并将其局部注射于大鼠脊髓损伤区域进行评价,验证该水凝胶载药系统的安全性与应用效果,为脊髓损伤的修复提供新的思路。【方法】1.载药热敏水凝胶的制备与性质测定:制备载药热敏水凝胶溶液(Nafamostat含量10mg/ml),并观察、记录其相转变温度,验证其随温度改变所发生的流变学变化,测定药物缓释能力。2.体外生物相容性实验:将20%载药热敏水凝胶溶液(Nafamostat含量10mg/ml)与海拉细胞共培养3天,镜下观察细胞形态、增殖情况变化,并通过MTT细胞毒性实验,与单纯Nafamostat溶液、未载药热敏水凝胶溶液、PBS溶液相对比,评价其对细胞活性的影响。3.水凝胶载药系统修复脊髓损伤的有效性评价:利用Impactor model-II脊髓打击器建立大鼠脊髓损伤(SCI)动物模型,损伤处局部注射20%载药热敏水凝胶溶液(Nafamostat含量10mg/ml)10ml,于术前、术后的第1天、第3天、第5天,以及1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周,对大鼠进行BBB运动功能评分,术后8周,通过脊髓组织切片HE染色观察大鼠脊髓损伤区域空洞面积,GFAP免疫组化染色观察损伤中心星形胶质细胞聚集情况,BDA顺行示踪观测神经纤维跨脊髓损伤区域能力,数字图像采用Image pro plus 5.0、Image J 2.1专业图像分析软件进行处理,数据采用统计学软件SPSS 15.0进行分析,数据以均数±标准差(Mean±SD)形式表示,显著性差异使用ANOVA testing计算,P0.05被认为具有统计学意义。【结果】1.水凝胶载药系统的性质:载药热敏水凝胶溶液的凝胶温度范围为35-56℃。通过透射电镜观察水凝胶呈类似球型的胶束或胶束团,直径在10到30 nm之间不等,药物颗粒均匀分散在凝胶胶束或胶束团中间。通过动态流变学分析,证实储能模量G’、损耗模量G”相交点约在34℃,此结果与试管倒置法测得的凝胶转变温度(35℃)接近。2.生物相容性评价:细胞毒性实验中,Nafamostat/PLGA-PEG-PLGA与海拉细胞共培养1天,2天,3天的镜下细胞形态未见明显异常,增殖情况良好。通过MTT实验可观察到,20%载药热敏水凝胶溶液(Nafamostat含量10mg/ml)相比20%的未载药热敏水凝胶溶液、10mg/ml的Nafamostat溶液与PBS溶液,与海拉细胞共培养3天,对于细胞相对活性的影响,各组比较无统计学意义(P0.05)。3.运动功能评分:在脊髓损伤模型制备前,实验动物的BBB评分为21分。手术造成脊髓受损,术后所有的实验动物都表现出双后肢的瘫痪,BBB评分0分。自脊髓损伤后1天至1周,各组BBB评分比较无统计学意义(P0.05)。术后2周,各组之间的分值比较出现统计学意义(P0.05)。至实验结束,即术后8周时,载有Nafamostat的热敏水凝胶组的BBB评分为12.10±0.88,明显高于其他三组,即:单纯热敏水凝胶组10.40±0.84,单纯Nafamostat组9.30±0.95,对照组7.70±0.82(P0.05)。4.组织形态学观察:在脊髓损伤术后的8周,观察脊髓组织的切片,可见对照组的大鼠脊髓损伤区域空洞面积最大,损伤区域的细胞形态最差,神经纤维稀疏,大量瘢痕组织形成,损伤区面积明显大于其余3组(P0.001)。单纯热敏水凝胶组,单纯Nafamostat组的损伤区域都明显减小,坏死组织、胶质瘢痕、炎性组织也较对照组减少。而承载Nafamostat的热敏水凝胶组损伤面积最小。5.免疫组化染色:术后8周,纵切脊髓组织,行GFAP免疫组化染色,观察损伤中心,可见单纯热敏水凝胶组,单纯Nafamostat组,承载Nafamostat的热敏水凝胶组的GFAP阳性面积明显小于对照组(P0.001),而承载Nafamostat的热敏水凝胶组GFAP阳性面积较其他各组最小,具有统计学意义(P0.01)。通过各组动物的BDA染色可观察到,BDA染色阳性的皮质脊髓束大部分走行于对侧脊髓白质的后索,承载Nafamostat的热敏水凝胶组中,大鼠的神经纤维可以跨过脊髓损伤区域,而其余各组跨损伤区域的神经纤维则较少,其中对照组最少。【结论】本团队制备的承载Nafamostat的热敏水凝胶溶液具有良好的药物分散性,释放药物过程平稳、缓慢,且具有良好的生物相容性。将载药水凝胶局部注射于大鼠脊髓损伤部位,相比单纯药物的一过性局部应用,能够通过药物扩散与缓释的方式更长时间作用于损伤局部,显著改善脊髓损伤后大鼠的运动功能,缩小脊髓损伤区域空洞面积,减少星形胶质细胞与胶质瘢痕生成,促进神经突触再生,调节脊髓损伤处微环境,起到修复脊髓损伤的作用。本研究为提高脊髓损伤修复效率提供了理论基础。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.2
【图文】：

同温度下热敏水凝胶溶液形态观察，（A）（B）两图左边均为未载，右边均为载药热敏水凝胶；（C）43℃时未载药热敏水凝胶发生沉敏水凝胶在 50℃依然为凝胶态图 2. 未载药和载药热敏胶溶液（20wt%）的 TEM 照片

不同温度下热敏水凝胶溶液形态观察，（A）（B）两图左边均为未载药胶，右边均为载药热敏水凝胶；（C）43℃时未载药热敏水凝胶发生沉淀热敏水凝胶在 50℃依然为凝胶态C D

Nafamostat的累积释放率

【参考文献】

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1 彭岱;王汉东;;干细胞在脊髓损伤治疗现状与进展[J];医学研究生学报;2013年11期

2 郝定均;谢恩;陈博;吴起宁;周丽君;张子如;窦榆生;;修复脊髓损伤的仿生多孔水凝胶的制备研究[J];生物骨科材料与临床研究;2013年05期

3 黄成;杨建东;冯新民;李广峰;李艺楠;肖海祥;孙钰;;季铵盐壳聚糖三维支架复合GNDF载间充质干细胞向神经样细胞分化[J];中国组织工程研究;2013年42期

4 王海宝;马学强;刘曾旭;王向东;刘德明;;许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植修复大鼠脊髓损伤(英文)[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年38期

5 廖列文;刘正堂;岳航勃;崔英德;;电场敏感智能水凝胶的研究进展[J];化工进展;2008年11期

6 程朝辉;郑启新;郑瑾;郭晓东;吴永超;;移植定向诱导的人骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤[J];中华实验外科杂志;2007年06期

7 纪江峰;冯世庆;;脊髓损伤动物模型研究进展[J];中华实验外科杂志;2006年09期

8 赵育;陈国华;孙明昆;晋治涛;高从X&;;pH敏感性羟乙基甲壳素/聚丙烯酸水凝胶的制备及其释药性能研究[J];生物医学工程学杂志;2006年02期

9 程映华,梁晶,王晓冬,张沛云,郑祖根,顾晓松;壳聚糖神经干细胞复合物修复大鼠完全性脊髓损伤的组织学观察[J];中华实验外科杂志;2004年01期

10 李贤真,李彦锋,朱晓夏,李柏年,刘刚;高分子水凝胶材料研究进展[J];功能材料;2003年04期

本文编号：2766388