胶原支架结合CBD-VEGF促进大鼠部分肺切除后的修复与再生研究

发布时间：2020-07-24 17:32

【摘要】：背景和目的肺移植是终末期肺病的唯一治疗方法,但它面临许多问题,如原发性肺移植功能障碍,供体器官短缺,存活率低和长期免疫抑制。这使得人们迫切需要找到一种新的治疗手段,解决损伤肺组织的再生问题。随着组织工程的不断发展,越来越多的生物材料运用于损伤组织器官的修复和再生,比如皮肤、骨、子宫、脊髓、心肌等已陆续被证实可以在部分结构或功能上得到再生和修复,这提示生物材料同样可能用于肺损伤的修复。但目前关于肺组织被材料修复的报道很少,血管内皮细胞的覆盖不足是一个主要问题,其可导致血管通透性增加、肺水肿、凝固和阻止肺泡再生。而VEGF作为已知最强的促血管生成因子,可以促进血管内皮细胞的生成;另外有报道称VEGF有抑制血管内皮细胞凋亡的作用,这可以抑制炎性细胞的浸润。同时有研究证实,VEGF有促进Ⅱ型肺泡上皮细胞迁移和转变为Ⅰ型肺泡上皮细胞的功能。基于以上研究,我们设想利用一种与胶原有特异结合能力的VEGF(CBD-VEGF)修饰胶原材料,利用CBD-VEGF与胶原材料的特异结合能力,避免CBD-VEGF在材料移植后的迅速扩散,促进材料的功能化,同时设计大鼠部分肺切除模型,将修饰了CBD-VEGF的胶原材料植入肺受损部位,通过与对照组比较,观察其对肺损伤修复和再生能力。方法1.通过外科手术方法切除SD大鼠二分之一右下肺叶,给予止血、抗感染处理,制造急性肺损伤动物模型。2.我们构建了一个由胶原支架和具有胶原结合能力的VEGF组成的功能性三维支架,它们分别用于提供附着部位和促进血管形成,移植于肺缺损部位。3.将SD大鼠按照随机数子法随机分为4组,即正常组,损伤组,胶原材料植入组(Collagen组),胶原材料结合CBD-VEGF(CBD-VEGF/Collagen)植入组。每一组按照时间节点分为6组,即3、5、7天,1个月,每一小组5只SD大鼠。手术后对每一组大鼠在时间节点上进行血气分析检测,观察其肺功能变化。4.对7天实验组大鼠肺组织进行免疫组织化学染色,观察炎性细胞浸润和肺泡上皮干细胞活化迁移的情况。对1个月小组进行组织HE染色。观察血管和支气管、肺泡等的生成情况。结果:1.术后3,5和7天,血气分析显示CBD-VEGF/Collagen组PH,PO_2和SO_2均高于对照组和胶原组。对照组与CBD-VEGF/Collagen组之间的PH值有统计学差异,但缺损组与胶原组之间无统计学差异。对照组和CBD-VEGF/Collagen组之间的PO_2存在统计学显着差异。SO_2在缺陷组和CBD-VEGF/Collagen组之间存在统计学差异。2.术后1个月,血气分析显示CBD-VEGF/Collagen组PH,PO_2和SO_2均高于对照组和胶原组。PH,PO_2,SO_2在对照组和CBD-VEGF/Collagen组之间显示出统计学上显着的差异。胶原组与对照组的PH值存在统计学差异,CBD-VEGF/Collagen组与胶原组之间无统计学差异。胶原组和对照组在PO_2上有统计学差异,CBD-VEGF/Collagen组之间存在统计学差异。3.HE染色显示CBD-VEGF/Collagen组中有更多的新血管形成。在胶原材料部分中,在胶原材料深处观察到大直径气管,在手术后7天使用抗CD45抗体进行炎性细胞的免疫组织化学染色。CBD-VEGF/Collagen组在移植物的边界区域中显示出比胶原材料组更少的炎性细胞浸润。4.在术后7天使用抗AQP5抗体对Ⅰ型肺泡上皮细胞进行免疫荧光染色,在移植物边界区域发现了Ⅰ型肺泡上皮细胞,且CBD-VEGF/Collagen组比单一材料组有更多Ⅰ型肺泡上皮细胞生成。结论:1.胶原支架,特别是与CBD-VEGF联合使用时,可部分促进急性部分肺切除大鼠血气PH,PO_2和SO_2的恢复。2.胶原材料结合CBD-VEGF在大鼠肺急性损伤模型中可以促进新的血管、支气管、肺泡的生成。3.胶原材料结合CBD-VEGF可以减少急性肺损伤的炎性浸润,促进肺泡上皮干细胞迁移、活化。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R655.3
【图文】：

血气分析,PH值,氧分压,血气

采集管为直径 1mm 的细管与 1ml 注射器针头连接而成，可以并用封管液填充（封管液为肝素钠 12500U 加入 150ml 生理盐水配置而有斜切口，便于插入动脉内。用 1ml 注射器抽取 0.5ml 动脉血，夹闭近注入血气卡内，在血气分析仪上测得血气结果。在测血气前要调试血气分才可以用于实验分析。.2.4 采集组织：气分析完成后，用颈脱臼的方法处死 SD 大鼠，用手术剪剪开大鼠胸部剪开肋骨，暴露胸腔，剪取手术组织或者正常组织。将采集好的组织放聚甲醛溶液的 50ml EP 管。用于后续组织免疫染色或组织染色。实验结果.3.1 3、5、7 天实验动物血气分析结果

血气分析,氧分压,PH值,实验组

17图 2 长期实验组血气分析结果（A：PH 值的变化；B：氧分压的变化C：血氧饱和度的变化；* P <0.05，** P <0.01，ns：无统计学意义）了评估长期呼吸功能的恢复，在术后 30 天进行血气分析。胶原材VEGF 胶原材料组 PH 和 PO2均高于缺损组（图 2.A、C），表明胶原支架能有一定作用。此外，胶原材料中结合 VEGF 组的 PH，PO2和 SO2均高O2优于胶原材料组（图 2.B），提示 VEGF 与胶原支架材料有协同作用能恢复。

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图 3. 在术后 7 天使用抗 CD45 抗体对炎性细胞进行免疫组织化学染色。虚线表示移植物边界区域抗 CD45 抗体主要针对炎性细胞进行免疫组织化学染色，图 3 显示，与移植物边界区域中的胶原蛋白组相比，胶原材料组与胶原材料结合 CBD-VEGF 组相比具有更多的炎性细胞浸润。说明胶原材料结合 CBD-VEGF 的植入可以控制进行肺损伤的炎症。3.3.2 抗 AQP5 抗体染色结果

【参考文献】