COMP基因突变致病的机制研究及药物筛选

发布时间：2020-07-24 20:16

【摘要】：多发性骨骺发育不良(multiple epiphyseal dysplasia;MED),是一种罕见的遗传性骨病,患者以身材矮小和早发性骨关节炎为主要特征。目前发现,至少有六种不同基因的突变会导致MED的发生,孟德尔遗传方式既有常染色体显性遗传也有常染色体隐性遗传,而COMP基因突变是导致显性MED发生的其中一种基因。COMP基因编码的软骨寡聚物基质蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein)是一种分泌型蛋白,主要在软骨细胞的周围基质中表达,以维持细胞外基质的稳态。COMP单碱基突变导致骨骼发育不良的机制至今仍然不是完全清楚。相关文献研究发现COMP蛋白在T3结构域突变使蛋白错误折叠,导致在内质网滞留,引起内质网应激(ER stress)。本研究为了进一步研究COMP基因突变导致多发性骨骺发育不良的分子机制,建立了COMP突变的细胞模型,并进行了相关药物的筛选研究。1.我们从一个患有MED的四代家系中,采集患者全血样本,经二代测序分析和一代测序验证,确定了一个COMP基因突变,该突变位于11号外显子上即c.1201GA(p.D401N)。2.为了进一步研究COMP基因突变致病的分子机制,我们在细胞水平上进行了一系列的研究,同时构建了已报道过的COMP~(D472Y)和COMP~(T585M)。在HeLa细胞中瞬时转染COMP野生型质粒和COMP突变型质粒,通过免疫荧光和免疫印迹,发现与野生型正常分泌的COMP蛋白相比,突变型COMP蛋白滞留在内质网上,影响了蛋白的正常分泌,同时发现突变的COMP蛋白与COMP~(D472Y)蛋白的滞留和分泌情况一致,而COMP~(T585M)蛋白滞留和分泌较少,可能是因为COMP~(D472Y)与我们的突变都发生在COMP蛋白的T3重复结构域,而COMP~(T585M)发生在COMP蛋白的C-末端球状结构域。为了更加明确COMP基因突变对细胞的影响,我们构建了慢病毒系统,转导HeLa细胞,筛选到稳定表达野生型和突变型COMP蛋白的细胞模型,利用免疫印迹和免疫荧光实验发现,稳定转染的细胞与之前瞬时转染的细胞现象一致,突变的COMP蛋白在内质网上积累,不能正常分泌。通过实时荧光定量PCR,发现COMP突变型细胞较COMP野生型细胞相比,COMP基因在转录水平上无差异,说明突变型细胞中COMP蛋白的滞留主要是由于蛋白的翻译后水平发生了改变。3.突变型COMP在内质网上积累引起内质网发生异常,这可能与疾病的发生有很高关联性,利用相关药物减少突变型COMP蛋白的积累,有助于恢复内质网的功能,而且对于疾病的治疗有一定的参考价值。通过对相关文献研究考证,抗氧化剂乙酰水杨酸和白藜芦醇能够缓解突变COMP的滞留,我们利用这两种药物作用于建立的细胞模型,研究发现,在突变细胞系中,75 mM的乙酰水杨酸和100μM的白藜芦醇作用24 h,使突变细胞中滞留COMP减少。综上所述,本研究建立的COMP突变的细胞模型证实了突变型COMP蛋白在内质网上发生滞留,且蛋白分泌受损,但是COMP基因的表达水平并没有发生变化,证明了蛋白的滞留可能是由于蛋白的错误折叠。此外,通过药物筛选实验证明了乙酰水杨酸和白藜芦醇对突变型细胞具有一定的疗效作用。本研究的数据为临床上诊断MED以及用药提供依据,具有一定的理论意义和应用价值。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681
【图文】：

家系图,先证者,临床特征,家系图

图 2.1 先证者的临床特征及 MED 家系图谱A）先证者右手和左手的 X-ray 检查图像，X-ray 检查结果显示两侧指骨短而小，远端桡尺骨骨骺明显不规则分布。（B）正方形指男性，圆形指女性，黑色标识是患病者，箭头指先证者。Fig. 2.1 Clinical findings and Family pedigree of MED.ight hand and left hand X-ray of the proband, X-ray examination showed bilateral short and small

结构图,基因测序,杂合,健康人

图 2.2 COMP 基因测序分析以及突变位点在 III 型类钙调蛋白重复区的定位（A）COMP 基因杂合突变在 III-8、III-12 以及 II-5 的患者中被检出，IV-9 的健康人未发现此突变。（B）COMP 单体的结构图。N-末端结构域（NH2），II 型类表皮生长因子重复结构域，III 型类钙调蛋白重复结构域，C-末端结构域（COOH）。Fig. 2.2 Sequencing analysis of COMP gene and location of the COMP mutation with thecalmodulin-like repeat domain of COMP.(A) COMP gene heterogenous c.1201C>T (minus strand) was detected in patient lll-12, lll-8, ll-5whilst this mutation is absent in healthy members. (B) The structure of a COMP monomer, showing thelocations of the N-terminal domain (NH2), the EGF-like and calmodulin-like repeats, and theC-terminal domain (COOH), is shown at the top.2.4.3 讨论MED 是一种骨骼发育不良而又很难诊断的疾病，临床诊断中具有代表性的表型包含风湿学上的关节疼痛或者神经学上的肌病，但是最基本的骨骼发育不良（身材

定点突变,测序

第三章 COMP 突变蛋白的功能分析SPSS17 软件分析数据显著性。3.4 结果与讨论3.4.1 COMP 重组质粒的突变以及 FLAG 真核表达载体的构建以 GV230-eGFP-COMP 为模板，利用表 3.2 的三对突变引物，分别进行突变，得到 COMP-D401N、COMP-T585M 以及 COMP-D472Y 突变质粒，测序结果表明三个突变质粒均突变成功，如图 3.1 所示。野生型的 COMP 和突变成功的 COMP 构建于 FLAG 标签的真核表达载体上。以GV230-eGFP-COMP（COMP-D401N）质粒为模板，PCR 扩增野生型和突变型 COMP连接在 pcDNAyu-2FLAG-3C 载体上，挑选单克隆菌落，如图 3.2 酶切鉴定后，经测序验证构建成功。A B

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