MMP3、SOX9基因调控在人椎间盘退变髓核细胞中的作用研究
发布时间：2020-07-25 08:53
【摘要】：目的:探讨体外转染慢病毒介导的MMP3(metal matrix loproteinase 3)、SOX9(SRY2related high mobility group box gene 9)基因后对转染的人椎间盘退变髓核细胞产生的生物学效应。方法:筛选合适的腰椎间盘突出人群,选取需要手术治疗的患者,在进行手术时将切除的椎间盘髓核组织及时的分辨、保存,并用酶序贯消化的方法分离,并单层原代细胞培养(已完成相关课题),然后将退变的人椎间盘髓核细胞进行复苏、培养及鉴定。构建慢病毒介导SOX9载体、慢病毒介导MMP3-siRNA载体,慢病毒载体感染人椎间盘退变髓核细胞,并观察转染效力及转染对人椎间盘退变髓核细胞增殖的影响。RT-PCR技术检测人退变椎间盘髓核细胞内蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白的mRNA相对表达量。Western Blot检测人退变椎间盘髓核细胞内蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白的相对表达量。结果:1.复苏培养的人退变髓核细胞,原代培养的髓核细胞形态呈现不规则的变化,有三角形、四角形、短梭形等形状改变,细胞核较正常变大。2.免疫荧光测定慢病毒的转染效力,转染效率较高,可达到80-90%。3.MTT法显示:空白组与MMP3-siRNA/SOX9慢病毒空载体转染组生长情况没有明显差异;MMP3-siRNA基因干扰沉默组、SOX9过表达组促进髓核细胞增殖的作用与空白组、空载体组有明显差异,而且在共同转染MMP3-siRNA、过表达SOX9后,人退变髓核细胞增殖效果更加明显。4.Q-PCR检测显示:MMP3基因沉默后人退变髓核细胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白较对照组增加(P0.05);SOX9过表达后人椎间盘退变髓核细胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白较对照组增加(P0.05);共转染MMP3-siRNA、过表达SOX9后,人椎间盘退变髓核细胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白能力最强。5.Western Blot结果显示:MMP3基因沉默后人椎间盘退变髓核细胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白较对照组增加(P0.05);SOX9过表达后人椎间盘退变髓核细胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白较对照组增加(P0.05);共转沉默MMP3-siRNA、过表达SOX9后,人椎间盘退变髓核细胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白能力增强最为明显。结论:通过分子生物学手段进行MMP3基因沉默或促使SOX9基因过度表达均能促进退变椎间盘髓核细胞发生分裂增殖,并能提升退变髓核细胞对蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的分泌能力,即MMP3基因和SOX9基因有希望成为阻止人类椎间盘退变的新靶点。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5
【图文】：
青岛大学硕士学位论文实验结果变髓核细胞的复苏及细胞鉴别代人椎间盘髓核退变细胞在接种后，在倒置显微镜下观察，可发现细，有的形态不规则，细胞大小不等，悬浮在培养液内，4～6 天后，发在培养管壁。开始贴壁的细胞形态改变明显，呈类圆形、团簇状生长出伪足，呈现多角形、三角形、短梭形或梭形，细胞核变大，核仁明核，且胞浆内可发现分泌颗粒，细胞的折光性良好；当髓核细胞全部胞探出伪足，互相连接，呈片状。如图 1.1 所示，在培养 14d 后，可胞相互汇合，并有基质样物质沉淀在细胞的周围（图 A）。在培养约 核细胞汇合率可达 80%以上(图 B)。A B
原代髓核细胞汇合率可达 80%以上(图 B)。A B图 1.1 复苏培养的人椎间盘退变髓核细胞（X 400）注：A 图示培养 14 天后镜下所见；图 B 示培养 21 天后镜下所见。提取培养的人髓核细胞，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察，髓核细胞出现短梭形、多角形、三角形等形状改变，形态变化不规则，部分细胞核出现偏心现象，偏向胞壁的一侧，细胞核染色呈蓝色，细胞浆染色呈淡红色，离胞核越远，胞浆染色越浅（如图 2.1 所示）。A B C
实验结果 免疫荧光测定转染效力设计不同梯度的病毒液浓度，将病毒液 Lentivirus-NC （1×108TU/ml）稀释至 3不同浓度，分别转染人退变的椎间盘髓核细胞，于 72 小时后，显微镜下观察绿色光表达及细胞的状态（如图 2.1 所示）。结果为：病毒浓度为 1×108TU/ml 时，对退变髓核细胞的转染效率在 80%左右，细胞的状态尚好。感染复数（ MOI）指在染时病毒数量和细胞数量的比例值。(A MMP3 沉默组、B SOX9 过表达组) 。10稀释转染效力高于 100 倍与 1000 倍稀释，转染 72 小时后，转染效率最高的是 1:10释倍数组，明显高于其他两组，由此计算分析得出，当 MOI=43 时，病毒转染效最高。10 倍稀释 100 倍稀释 1000 倍稀释
本文编号：2769606
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5
【图文】：
青岛大学硕士学位论文实验结果变髓核细胞的复苏及细胞鉴别代人椎间盘髓核退变细胞在接种后，在倒置显微镜下观察，可发现细，有的形态不规则，细胞大小不等，悬浮在培养液内，4～6 天后，发在培养管壁。开始贴壁的细胞形态改变明显，呈类圆形、团簇状生长出伪足，呈现多角形、三角形、短梭形或梭形，细胞核变大，核仁明核，且胞浆内可发现分泌颗粒，细胞的折光性良好；当髓核细胞全部胞探出伪足，互相连接，呈片状。如图 1.1 所示，在培养 14d 后，可胞相互汇合，并有基质样物质沉淀在细胞的周围（图 A）。在培养约 核细胞汇合率可达 80%以上(图 B)。A B
原代髓核细胞汇合率可达 80%以上(图 B)。A B图 1.1 复苏培养的人椎间盘退变髓核细胞（X 400）注：A 图示培养 14 天后镜下所见；图 B 示培养 21 天后镜下所见。提取培养的人髓核细胞，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察，髓核细胞出现短梭形、多角形、三角形等形状改变，形态变化不规则，部分细胞核出现偏心现象，偏向胞壁的一侧，细胞核染色呈蓝色，细胞浆染色呈淡红色，离胞核越远，胞浆染色越浅（如图 2.1 所示）。A B C
实验结果 免疫荧光测定转染效力设计不同梯度的病毒液浓度，将病毒液 Lentivirus-NC （1×108TU/ml）稀释至 3不同浓度，分别转染人退变的椎间盘髓核细胞，于 72 小时后，显微镜下观察绿色光表达及细胞的状态（如图 2.1 所示）。结果为：病毒浓度为 1×108TU/ml 时，对退变髓核细胞的转染效率在 80%左右，细胞的状态尚好。感染复数（ MOI）指在染时病毒数量和细胞数量的比例值。(A MMP3 沉默组、B SOX9 过表达组) 。10稀释转染效力高于 100 倍与 1000 倍稀释，转染 72 小时后，转染效率最高的是 1:10释倍数组，明显高于其他两组，由此计算分析得出，当 MOI=43 时，病毒转染效最高。10 倍稀释 100 倍稀释 1000 倍稀释
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 谭树森;贾长青;刘振宁;刘瑞端;杨杰;张磊;寿奋勇;鞠晓军;;经超顺磁性氧化铁标记的自体BMSCs在兔椎间盘内存活时间研究[J];中国修复重建外科杂志;2009年11期
2 陈金武,吴军正,李焰,刘斌;sox9基因过表达诱导人骨髓基质干细胞向软骨细胞分化[J];临床口腔医学杂志;2003年12期
本文编号：2769606
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