TSA联合BMSCs对脊髓损伤小鼠的神经保护作用和机制研究

发布时间：2020-07-27 07:23

【摘要】：背景脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重的中枢神经系统损伤,主要临床表现为损伤平面以下的感觉、运动功能完全丧失及大小便失禁,其发病率以及致残率正逐年升高,给患者家庭和社会造成了沉重的负担,目前尚没有行之有效的治疗方法。干细胞具有自我更新、高度增殖的特点以及多向分化潜能,因此干细胞替代疗法成为治疗中枢神经系统损伤疾病的新起点。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)由于其取材方便、无免疫原性且无伦理问题,广泛用于干细胞替代疗法。但移植干细胞治疗中枢神经损伤疾病,也普遍存在移植后细胞存活率低、分化效率低和神经痛发生率高等缺点。表观遗传调控是一种以染色质为基础的基因表达调控手段,其中较为广泛的一类研究是组蛋白乙酰化。研究发现组蛋白的乙酰化水平与多种神经疾病相关,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)能促进干细胞成神经分化,发挥神经保护作用。研究发现HDACi能激活SDF1/CXCR4反应轴,促进干细胞向病灶部位迁移,同时HDACi可以使Nrf2乙酰化,激活Nrf2/ARE通路,有效减轻损伤后的炎症反应。曲古霉素A(trichostatin A,TSA)是一种稳定且高效的HDACi,关于TSA联合BMSCs在中枢神经系统损伤后是否具有神经保护功能的研究尚未见报道。本研究以此为背景,探究TSA联合BMSCs治疗对SCI小鼠的神经保护作用并探讨其作用机制。目的体外实验检测TSA对小鼠海马神经元细胞(hippocampal neuronal cell line,HT22)氧化损伤的保护作用;体内实验研究TSA联合BMSCs对SCI小鼠神经保护作用及其机制。方法第一部分:TSA对HT22细胞氧化损伤的保护作用实验分为对照组(NC组),H_2O_2损伤组和TSA+H_2O_2治疗组三组:1.CCK-8法检测细胞活力建立HT22细胞氧化损伤模型以及确定TSA的最适添加浓度;2.流式细胞术评价细胞凋亡情况,Transwell检测细胞迁移能力;3.ELISA试剂盒检测细胞中SOD和MDA表达情况,ROS试剂盒检测细胞中ROS的含量。第二部分:TSA联合BMSCs对SCI小鼠的神经保护作用及机制研究采用改良小鼠Allen’s法击打T10节段制备小鼠SCI模型,将小鼠随机分为生理盐水处理组(Vehicle组,Veh组)、TSA组、BMSCs移植组和TSA+BMSCs联合治疗组(N=127):1.采用BMS评分(Basso Mouse Scale)和斜面放置试验初步评价小鼠后肢运动功能的恢复状况,悬尾试验和糖水偏嗜实验评价小鼠的抑郁情况;2.CV染色检测损伤体积,干湿称重法检测小鼠损伤部位的脊髓水含量评价脊髓水肿;3.qRT-PCR检测神经营养因子BDNF、NT3和NGF以及神经元分化相关因子DCX、MAP2和NSE的表达量,免疫荧光染色检测脊髓损伤部位GFAP、MBP和NeuN的表达;4.ELISA试剂盒检测炎症相关因子TNF-α和IL-1β的表达情况,二氢乙锭(Het)染色检测损伤部位活性氧的表达,PI染色检测小鼠损伤部位坏死细胞数量,TUNEL试剂盒检测损伤部位坏死细胞的数量;5.Western blot检测Nrf2/ARE通路相关蛋白的表达。结果第一部分:TSA对HT22细胞氧化损伤的保护作用1.与H_2O_2组比较,TSA能减轻H_2O_2氧化损伤导致的HT22细胞活力降低,减少凋亡,促进迁移(P0.05);2.与H_2O_2组比较,TSA处理组SOD活力明显升高,MDA水平降低,体内ROS的积累减少,TSA治疗能明显减轻其导致的氧化损伤(P0.05)。第二部分:TSA联合BMSCs对SCI小鼠的神经保护作用及机制研究1.TSA+BMSCs联合治疗明显改善小鼠后肢运动功能和情绪状况,降低损伤体积,增加体重并减少脊髓含水量(P0.05);2.TSA+BMSCs治疗增加神经分化和神经营养相关因子的表达,减轻炎症反应,减少GFAP的表达,减少了星形胶质细胞的活化,同时降低活性氧的表达(P0.05);3.TSA+BMSCs治疗增加了NeuN的表达,增加存活神经元数量,MBP面积增加,减少了白质损伤,同时降低损伤部位坏死和凋亡细胞数量(P0.05);4.Western blot结果显示TSA能增加Nrf2的表达,降低Keap1的表达,同时增加其下游蛋白SOD1和NQO1的表达,表明TSA能激活Nrf2/ARE通路(P0.05)。结论1.TSA治疗能减轻H_2O_2导致的神经元细胞氧化损伤;2.TSA联合BMSCs通过激活Nrf2/ARE通路和减少ROS的积累,减轻SCI小鼠病灶部位的炎症反应和氧化损伤,减少细胞坏死和凋亡,起到神经保护的作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.2
【图文】：

H2O2损伤后细胞存活率和TSA对损伤HT22细胞活力的影响

流式细胞仪检测各组的细胞凋亡率

Transwell小室观察各组HT22细胞的迁移(200×)

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;Effect of valproic acid on endogenous neural stem cell proliferation in a rat model of spinal cord injury[J];Neural Regeneration Research;2009年07期

本文编号：2771532