低浓度二甲基亚砜对RANKL诱导的RAW264.7细胞破骨分化影响的体外研究

发布时间：2020-07-27 08:31

【摘要】：目的DMSO在临床及科研中被广泛应用,但其对于细胞的影响常被忽略。本研究旨在检测低浓度DMSO对RANKL诱导的RAW264.7细胞破骨分化的影响,降低DMSO的使用浓度,为低浓度DMSO在临床及科研中的使用提供实验依据。方法1细胞增殖检测:细胞接种在96孔板上,50ng/ml RANKL诱导24小时后,RANKL诱导液中分别加入0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八种低浓度的DMSO继续培养,DMSO作用第1,3,5,7,9天时,检测各组细胞数。2 TRAP活性检测:细胞接种在96孔板上,50ng/ml RANKL诱导细胞24小时后,采用0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八种低浓度的DMSO诱导培养4天后,按照TRAP活性检测试剂盒使用说明,酶标仪检测各组吸光光度值,用BCA蛋白试剂盒检测各组蛋白浓度,各组吸光光度值与蛋白浓度的比值即为TRAP活性值。3 TRAP染色及形态学分析:细胞接种在48孔板上,50ng/ml RANKL诱导细胞24小时后,以0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八种低浓度的DMSO作用于细胞4天后,按TRAP染色试剂盒使用说明进行TRAP染色。室温晾干,光学显微镜收集各组影像,每组随机拍摄20张照片,使用Image-Pro Plus 6.0软件对图像进行测量,记录每张照片中RAW264.7细胞TRAP染色阳性的细胞总数,总面积及单个细胞内细胞核个数。4破骨分化相关基因表达检测:细胞接种于6孔板,采用0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八种低浓度的DMSO和RANKL联合刺激培养4天后,提取RNA,逆转录合成c DNA,然后根据实时荧光定量PCR试剂盒使用说明进行实时荧光定量PCR检测。5钙盐吸收能力检测:细胞接种于底部为磷酸盐涂层的破骨细胞分析基质板(OAAS板),采用0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八种低浓度的DMSO作用于经50ng/ml RANKL诱导24小时后的细胞,联合刺激培养10天,观察OAAS板上的钙盐吸收陷窝,室温下晾干,光学显微镜随机收集各组照片,使用ImagePro Plus 6.0软件对每张照片中钙盐吸收陷窝面积进行测量。结果1细胞增殖:第1天,各组间细胞数相近,无显著差异(P0.05);第3天,所有DMSO与RANKL联合诱导刺激组的细胞数均为RANKL单独诱导组细胞数的1.5倍以上,各组与RANKL单独诱导组均有统计学差异(P0.01);第5天,与单独RANKL诱导组相比,0.001%DMSO组细胞数显著增多(P0.01),0.005%DMSO和0.01%DMSO对细胞增殖的促进作用有所减弱,0.2%浓度DMSO对细胞增殖的促进作用最强;第7天,各组细胞均明显增殖,各组增殖趋势与第5天大致相同;第9天,各组细胞数较第7天均有增长,0.1%DMSO组细胞数最高,但与其它各组均无统计学差异(P0.05),而RANKL单独应用组与RANKL与DMSO联合应用组组间亦无统计学差异(P0.05)2 TRAP活性:各浓度DMSO组与RANKL联合应用组较RANKL单独诱导组TRAP活性均有所下降,且表现为随DMSO浓度增高TRAP活性下降的趋势,且各DMSO作用组均与单纯RANKL诱导组存在统计学差异(P0.01)。3 TRAP染色与形态学分析:1)破骨细胞总面积:较RANKL单独诱导组相比,DMSO浓度为0.005%和0.01%时,RAW264.7细胞形成破骨细胞的总面积均显著增大(P0.01),DMSO浓度为0.005%时破骨细胞总面积达峰值;随DMSO浓度进一步提高为0.1%,0.15%,0.2%时,破骨细胞总面积随浓度升高而减小;DMSO浓度为0.001%,0.05%,0.1%时,破骨细胞总面积与未加DMSO组无显著性差别(P0.05),DMSO浓度为0.15%,0.2%时破骨细胞总面积均显著低于单独RANKL诱导组(P0.01)。2)破骨细胞数:单个培养孔内,与RANKL单独诱导组相比,0.001%DMSO组破骨细胞数量多于RANKL单独诱导组,且DMSO作用组均与单独RANKL诱导组无统计学差异(P0.05)。DMSO浓度为0.05%、0.1%、0.15%时,破骨细胞数量与RANKL单独诱导组相比均显著增加(P0.01)。0.2%DMSO组较RANKL单独诱导组破骨细胞数量有所增加,但无统计学差异(P0.05)。3)破骨细胞平均面积:与单纯RANKL诱导组相比,DMSO浓度为0.005%和0.01%时,破骨细胞平均面积显著增大(P0.01),且0.05%与0.01%两组间有统计学差异(P0.01),随着DMSO浓度进一步提高为0.05%,0.1%,0.15%和0.2%时,破骨细胞平均面积随浓度升高而减小,与RANKL单独诱导组均有统计学差异(P0.01)。4)各组破骨细胞细胞核数:与RANKL单独诱导组相比,DMSO浓度为0.001%时单个破骨细胞所包含的细胞核数少于3个的细胞数最少,DMSO浓度为0.15%时单个破骨细胞所包含的细胞核数少于3个的细胞数最多,两组均与RANKL单独诱导组存在统计学差异(P0.01);与RANKL单独诱导组相比,DMSO浓度为0.005%时单个破骨细胞所包含的细胞核数在3到20个的细胞数最少,DMSO浓度为0.1%时单个破骨细胞所包含的细胞核数在3到20个的细胞数最多,两组均与RANKL单独诱导组存在统计学差异(P0.01);与RANKL单独诱导组相比,DMSO浓度为0.005%时单个破骨细胞所包含的细胞核数多于20个的细胞数最多,DMSO浓度为0.2%时单个破骨细胞所包含的细胞核数多于20个的细胞数最少,两组均与RANKL单独诱导组存在统计学差异(P0.01)。4破骨分化相关基因表达:1)Acp5基因:与RANKL单纯诱导组相比,除0.001%DMSO组促进了Acp5基因表达,其余浓度DMSO组均抑制了Acp5基因表达。2)Calcr基因:0.001%DMSO和0.01%DMSO组均促进了Calcr基因表达,但与RANKL单纯诱导组相比均无统计学差异(P0.05),其余浓度DMSO组均抑制了Calcr基因表达。3)Ctsk基因:与RANKL单纯诱导组相比,除0.001%DMSO组促进Ctsk基因表达,其余浓度DMSO组均抑制了Ctsk基因表达。5钙盐吸收能力检测:较RANKL单独应用组相比,0.001%DSMO组所形成的钙盐吸收陷窝面积显著增大(P0.01),0.005%DMSO组所形成的钙盐吸收陷窝面积大于RANKL单独应用组,但已无统计学差异(P0.05),随着DMSO浓度升高,钙盐吸收面积呈逐渐减少的趋势,并在0.2%DMSO组达到最小值。结论1 DMSO具有促进破骨细胞增殖的作用,并随浓度增高抑制TRAP活性及破骨相关基因表达。2破骨细胞表面积随DMSO浓度升高表现为钟形曲线,DMSO浓度为0.005%和0.01%时较单纯RANKL诱导组表现为促进作用,但随DMSO浓度升高,逐渐转为抑制作用。3破骨细胞TRAP活性的高低,TRAP染色阳性细胞面积的大小并不能够直接等同于这类细胞钙盐吸收能力以及骨吸收能力的强弱。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68
【图文】：

实验结果均使用 SPSS 17.0 统计软件进行数据处理，不同浓度 DMSO 组间的数据差异采用单因素方差分析（ANOVA）,各组数值为均数±标准差（Mean±SD）,定义 P<0.05 有统计学差异。1.3 实验结果1.3.1 RAW264.7 细胞倒置相差显微镜镜下观察RAW264.7 细胞(图 2)复苏及接种后，表现为未贴壁的漂浮状态。长势状态良好的 RAW264.7 细胞在孵育箱中培养 1-2 小时左右后可贴壁，2 小时后细胞贴壁率可达到总数的 80%-90%。此时可在镜下观察其形态，RAW264.7 细胞呈圆形或卵圆形，透明度较好，胞质明确，界限清晰并呈散在分布，细胞体积较小且形态较单一，故分化现象不明显。在培养细胞的过程中，可通过显微镜观察其增殖速度及融合密度，镜下观察细胞融合率 80%以上时，可进行传代。

同浓度 RANKL 诱导 RAW264.7 细胞破骨分化 TRAP 染色别采用 10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml 以及 100ng/ml RANKL 诱导 天后，使用光学显微镜镜下观察 RANKL 诱导 RAW264.7 细胞 TTRAP 染色阳性的破骨细胞如图 5 所示。 10ng/ml RANKL 诱导的细胞镜下可见极少的多核样细胞，经 诱导细胞虽然可见部分 TRAP 染色阳性的破骨细胞，但数量少，能构建理想的破骨细胞分化模型。而经 50ng/ml 和 100ng/ml RAN4.7 细胞均有较多 TRAP 染色阳性的成熟破骨细胞出现，表现为多用于检测不同浓度 DMSO 对 RAW264.7 细胞破骨分化的影响，使s 6.0 软件对各浓度 RANKL 诱导的 RAW264.7 细胞破骨总面积和行定量分析，结果如图 3，图 4 所示，由于 50ng/ml 和 100ng/ml R分化的能力相近，因此采用 50ng/ml RANKL 诱导 RAW264.7 细

图 4 不同浓度 RANKL 诱导 RAW264.7 破骨细胞总数（**P<0.01，*P<0.05，n=3）.4 The total number of osteoclast induced by different concentration of RA（**P<0.01，*P<0.05，n=3）

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本文编号：2771602