UBE2T联合放疗对骨肉瘤生长及肺转移的抑制作用

发布时间：2020-08-03 06:42

【摘要】：骨肉瘤是源自间充质组织的恶性肿瘤,其主要发生在青少年中,由于其侵袭性生长及早期的肺部转移,导致其预后较差。既往的治疗措施多为患肢截肢以及术后的放、化疗,但5年生存率仍小于20%,近年来临床上所采用的新辅助化疗联合保肢手术使得患者的预后出现明显的改善,患者的生存质量也显著提高,但是在进行化学治疗时常会导致诱导抗药细胞的出现以及许多病人因化学抗癌药的毒副作用不得不终止治疗,使得部分患者的预后仍不乐观。为此,针对骨肉瘤的特点及基因特异性,诞生了一些靶向药物,并发现了相关的基因靶点,部分药物如Endostar等也已投入临床进行使用,并发挥了较好地肿瘤治疗效果,以上理论使骨肉瘤的临床治疗进入了精准治疗的新时代。通过联合这些新型的靶向药物以及针对这些相关的基因位点进行作用,使得既往对骨肉瘤而言较为不敏感的放射治疗成为了治疗的新手段。近年的研究证实,多种基因与骨肉瘤的放射敏感性有关。C Blattmann等人通过研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂,发现抑制组蛋白去乙酰化酶后,研究中所选取的两种骨肉瘤细胞系(KHOS-240S和SAOS2)以及两种横纹肌肉瘤细胞系(A-204和RD)都显示出对放射治疗的显著敏感性增强,与对照组相比,实验组细胞在增殖与凋亡等生物特性方面出现了显著差异。N Chen则证实通过敲除Autophagy蛋白-5途径沉默NRF2可使骨肉瘤细胞系U20S对放射治疗的抵抗性消失,相关基因及蛋白如p65、Bcl-2表达水平降低,而p53及Bax表达升高,并最终证实其相应的细胞通路为ERK 1/2通路。而FB Mantovani等也通过对表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)进行研究,证实其通过VEGF等相关靶点作用于PKB/Akt信号通路增强了骨肉瘤细胞对射线的敏感性,其放疗增敏效应在体内及体外实验研究中均得到了验证。经过近年来的基础及临床实验,研究者们发现了众多与放疗敏感性相关的基因位点及相关通路,在这种背景下,我们对泛素偶联酶2T(ubiquitin-conjugating enzyme T,UBE2T)基因与骨肉瘤放射治疗敏感性的关系进行了研究。UBE2T基因属于泛素结合酶家族中的一员,而泛素蛋白酶体途径是蛋白降解的主要途径,也是恶性肿瘤侵袭及转移的重要步骤之一,在此过程中,泛素通过泛素激活酶(E1)、泛素偶联酶(E2)以及泛素连接酶(E3)三个步骤转移至底物蛋白上,对底物蛋白进行识别及分解。既往研究证实泛素偶联酶在肿瘤的放疗增敏中有着重要作用。一项关于宫颈癌放射治疗的研究证实,通过沉默泛素偶联酶C(UBE2C)可使SiHa以及HeLa细胞系对放射治疗的敏感性增强,原本是宫颈癌中放疗抵抗效应最显著的SiHa细胞也对放射治疗表现出了极高的敏感性,与对照组相比,细胞的增殖及侵袭性出现显著降低。而另一项关于乳腺癌的研究则证实:乳腺癌细胞中UBE2C基因表达较癌旁细胞显著为高,而通过沉默UBE2C则增强了乳腺癌细胞HBL100以及HEK293T对放疗、三氧苯胺、他莫昔芬以及来曲唑的敏感性,进一步证实了 UBE2C在放疗增敏过程中的作用。其它关于乳腺癌的研究也得到了上述结论:沉默UBE2C可促进乳腺癌的放疗增敏作用。UBE2T是泛素偶联酶家族中的重要一员,在上皮-间质转化及间质-上皮转化中起着重要作用,其在多种肿瘤的生长、侵袭、转移中也被发现是重要的相关基因靶点,如肺癌、乳腺癌、胃癌等,近期的研究也证实UBE2T在骨肉瘤的生长及侵袭中也发挥了重要作用。在上述背景之下,并结合近期的研究结果,我们认为UBE2T可能也在相关肿瘤的放疗增敏中扮演着重要角色,因此我们选择UBE2T作为研究目标及靶点并对其在骨肉瘤细胞中的放疗增敏作用进行了研究,同时评价了 UBE2T联合放射治疗对于骨肉瘤细胞肺转移的作用。本研究通过临床和基础相结合的手段,首先评价了 UBE2T在发生肺转移及非肺转移的骨肉瘤患者中的表达情况,并对其在多种骨肉瘤细胞株中的表达情况进行研究,然后构建了 UBE2T沉默慢病毒载体,观察其联合放射治疗对骨肉瘤细胞增殖、迁移的作用,同时在体内构建荷瘤小鼠模型,以评估此种联合疗法对肿瘤生长和肺转移的影响,最终证实UBE2T在骨肉瘤生长和肺转移的放射增敏中起着重要作用,为下一步骨肉瘤基因联合放疗奠定基础,同时为临床转移性骨肉瘤的诊断和治疗提供了新的可能靶点。第一章UBE2T在人骨肉瘤标本及人骨肉瘤细胞系中的表达情况研究研究目的:研究人骨肉瘤标本切片癌组织与癌旁组织中UBE2T的表达情况,同时比较肺转移及非肺转移骨肉瘤患者的癌组织中UBE2T表达情况,从临床层面确定UBE2T在骨肉瘤中的表达;同时对四种骨肉瘤细胞系进行UBE2T的表达研究,确定其在骨肉瘤细胞系中的表达丰度。研究方法:1.采用免疫组化的方法对在临床收集的骨肉瘤患者的标本进行研究,分析癌组织与癌旁组织中UBE2T的表达情况,同时比较肺转移及非肺转移骨肉瘤患者的癌组织中UBE2T表达情况,确定UBE2T与骨肉瘤侵袭性的联系。2.采用q-PCR的方法检测骨肉瘤细胞系U20S、Saos-2、MG-63、HOS中的表达丰度。研究结果:1.UBE2T在骨肉瘤患者的癌组织中表达呈阳性,癌旁组织中呈阴性;2.在出现肺转移的患者中,其原位骨肉瘤组织的UBE2T表达水平显著高于非肺转移的骨肉瘤患者;3.UBE2T在U20S、Saos-2、MG-63、HOS四种骨肉瘤细胞系中均呈高丰度表达,其中在USOS中表达丰度为最高。研究结论:通过在癌组织与癌旁组织的表达情况比较以及在肺转移患者与非肺转移患者中表达情况的比较,我们认为UBE2T与骨肉瘤的侵袭性及肺转移呈正相关。第二章SiRNA-UBE2T对骨肉瘤细胞U20S生长及迁移的放疗增敏作用研究目的:构建UBE2T干扰慢病毒载体(SiRNA-UBE2T),评价其联合放射治疗在骨肉瘤细胞系U20S体外生长、克隆及迁移中的作用。研究方法:1.采用分子生物学及细胞生物学手段构建UBE2T干扰慢病毒载体(SiRNA-UBE2T),并对骨肉瘤细胞U20S进行感染,采用q-PCR及WesternBlot手段测定其对UBE2T表达敲减情况的作用。2.将骨肉瘤细胞 U20S 进行分组(SiRNA-Ctrl、SiRNA-UBE2T、SiRNA-Ctrl 联合放射治疗组(IR+SiRNA-Ctrl)以及SiRNA-UBE2T联合放射治疗组(IR+SiRNA-UBE2T))治疗,利用Celigo细胞计数法、CCK-8评价U20S细胞的增殖情况,利用平板克隆形成实验评价U20S克隆形成情况,利用细胞划痕实验验证联合治疗后U20S的迁移情况,利用流失细胞仪测定各组细胞的凋亡情况。研究结果:1.成功构建了 UBE2T干扰慢病毒载体(SiRNA-UBE2T),其可使U20S中UBE2T的表达显著降低;2.SiRNA-UBE2T联合放射治疗组中,U20S细胞的增殖、克隆以及迁移速度较其他3组显著降低,而凋亡率较其他三组显著为高。研究结论:SiRNA-UBE2T联合放射治疗可在体外显著降低U20S细胞的增殖、克隆以及迁移速度,并促进其凋亡。第三章SiRNA-UBE2T对小鼠体内骨肉瘤生长及肺转移的放疗增敏作用研究目的:构建U20S荷瘤小鼠模型,评价SiRNA-UBE2T联合放射治疗对原位肿瘤生长及肺转移的作用,并初步探讨其作用靶点及机制。研究方法:1购买重症联合免疫缺陷小鼠(SCID),并在其背部进行骨肉瘤细胞皮下接种,构建SCID荷瘤模型。2.将小鼠进行分组(SiRNA-Ctrl、SiRNA-UBE2T、IR+SiRNA-Ctrl 组以及 IR+SiRNA-UBE2T组)治疗,评价小鼠原位肿瘤生长情况,并在其处死后观察其肺转移、肺湿重等情况。3.采用免疫组化手段评价波形蛋白(Vimentin)与凋亡相关蛋白(Bax、Caspase-3)在各组肿瘤中表达情况。研究结果:1.IR+ SiRNA-UBE2T组中小鼠肿瘤显著较其他3组为小,并在第6周出现肿瘤减小的趋势,且本组小鼠中均未出现肺转移情况的发生;2.SiRNA-UBE2T联合放射治疗组中,Vimentin表达水平最低,而Bax、Caspase-3表达水平最高;研究结论:SiRNA-UBE2T联合放射治疗可显著减弱小鼠骨肉瘤的生长并降低肺转移机率,SiRNA-UBE2T可对小鼠的骨肉瘤呈现放疗增敏的作用,其作用机制可能是通过Vimentin及Bax、Caspase-3等实现。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738
【图文】：

骨肉瘤,癌组织,数值

图１．２四种骨肉瘤细胞系中ＵＢＥ２Ｔ的ＡＣｔ数值逡逑

细胞,荧光,视野,转染

图２．１邋ｓｈＣｔｒｌ及ｓｈＵＢＥ２Ｔ转染Ｕ２０Ｓ细胞后明视野及荧光视野图像（１００ｘ）逡逑（２．邋１－Ａ邋ｓｈＣｔｒｌ邋明视野；２．１－Ｂ邋ｓｈＣｔｒｌ邋荧光视野邋１００ｘ；邋２．邋１－Ｃ邋ｓｈＵＢＥ２Ｔ邋明视逡逑野；２．１－Ｄ邋ｓｈＵＢＥ２Ｔ荧光视野）逡逑

细胞,荧光,视野,转染

附图：逡逑ｍｍ逡逑■■逡逑图２．１邋ｓｈＣｔｒｌ及ｓｈＵＢＥ２Ｔ转染Ｕ２０Ｓ细胞后明视野及荧光视野图像（１００ｘ）逡逑（２．邋１－Ａ邋ｓｈＣｔｒｌ邋明视野；２．１－Ｂ邋ｓｈＣｔｒｌ邋荧光视野邋１００ｘ；邋２．邋１－Ｃ邋ｓｈＵＢＥ２Ｔ邋明视逡逑野；２．１－Ｄ邋ｓｈＵＢＥ２Ｔ荧光视野）逡逑１．２００邋｜逦

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