右美托咪定对缺血再灌注脑损伤的保护作用和机制研究

发布时间：2020-08-08 11:01

【摘要】：脑组织短暂缺血即可引起严重的急性脑损伤,而恢复血流灌注后,其功能不但未能恢复,还会在血流恢复过程中启动一系列复杂级联反应造成神经细胞的凋亡、坏死,导致延迟性神经功能障碍,称为脑缺血再灌注损伤(Ischemia-ReperfusionInjury,IRI)。脑 IRI 引起的延迟性神经功能障碍将给患者及家庭带来巨大的精神痛苦和经济负担。临床上神经外科手术、心血管大手术、休克和心跳骤停等危重病人抢救过程中,均有发生潜在急性缺血再灌注脑损伤的危险。目前,对于脑IRI的治疗临床上缺少有效药物,因而围术期的脑保护具有重要临床意义。近年来,大量研究表明:炎性反应诱导的神经细胞凋亡是脑IRI的重要机制。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide 3-kinase/protein kinaseB,PI3K/Akt)通路是与炎症、细胞凋亡有关的重要信号传导通路。PI3K激活时生成PIP3,后者可激活下游Akt,通过其活化形式p-Akt,产生神经生长因子和神经营养因子抑制神经元凋亡;PI3K/Akt还可以调控其下游信号分子如NF-kB、Bax、Bcl-2等蛋白的活化及表达,从而抑制炎性反应和凋亡的发生,促进细胞存活。右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是目前临床常用的新型麻醉辅助药。近年来研究发现,Dex可减少肾小管上皮细胞及心肌细胞的凋亡,在围术期对缺血再灌注诱导的心肾等脏器损伤有一定保护作用;在脓毒症患者镇静过程中还能减少促炎因子的释放,减轻炎症反应发挥脏器保护作用。以上研究显示右美托咪定具有抗炎抗凋亡效应。据此我们提出假设,IRI时Dex可提供脑保护作用,改善患者神经功能。本研究内容包括以下两个方面:(1)在整体动物水平,检验急性脑IRI时Dex是否可以减少炎症反应和凋亡,发挥神经保护作用;(2)在体外细胞水平,探讨PI3K/Akt/NF-kB通路是否参与了 Dex的神经保护效应。具体如下:第一部分:Dex对大鼠缺血再灌注脑损伤的神经保护作用目的:动物在体实验评估Dex对大鼠急性局灶性缺血再灌注脑损伤的神经保护作用。方法:60只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组,脑缺血再灌注(I/R)组和Dex干预(D+I/R)组。脑缺血再灌注组和Dex干预组采用右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)lh再灌注24h建立局灶性脑缺血再灌注动物模型,Dex干预在缺血后即刻给予。再灌注24h后Longa评分法及提高躯体摆动实验(BEST)检测大鼠神经功能缺陷并测定脑水肿程度;HE染色观察海马组织病理形态学变化;TUNEL荧光染色检测海马组织细胞凋亡水平;免疫组化染色检测海马CA1区的NF-kBp65蛋白阳性表达;Elisa和RT-PCR法分别检测海马组织中炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的水平和mRNA表达;Western Blot免疫印迹法检测海马中Bcl-2、Bax、p-Akt蛋白的表达水平。结果:1.1 Dex对缺血再灌注大鼠神经功能和脑水肿损伤的影响:与假手术组比较,脑缺血再灌注组大鼠神经功能评分、左侧旋转次数百分比及脑水肿程度均明显增加,出现急性神经功能缺失;Dex干预组大鼠神经功能缺陷明显缓解,脑水肿程度也明显减轻,各检测指标均低于脑缺血再灌注组大鼠,差异有统计学意义(P0.05)。1.2 Dex对缺血再灌注大鼠海马组织病理形态改变的影响:HE染色显示脑缺血再灌注组大鼠海马区神经细胞呈不同程度损伤性改变,细胞层次不清,排列散乱,细胞数量减少,部分神经元皱缩,核固缩、深染,核仁不清晰,以CA1区细胞变化最为明显;而Dex干预组大鼠海马各区神经细胞病理形态变化明显减轻。1.3 Dex对缺血再灌注大鼠海马组织中细胞凋亡的影响:脑缺血再灌注组大鼠海马组织TUNEL阳性(绿色荧光)细胞明显增多;Dex干预组与脑缺血再灌注组相比,大鼠海马组织TUNEL阳性细胞明显减少,差异有统计学意义(P0.01)。1.4 Dex对缺血再灌注大鼠海马组织炎性因子水平的影响:脑缺血再灌注组大鼠海马组织中炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的水平和mRNA表达均明显高于假手术组;与脑缺血再灌注组比较,Dex干预组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平及mRNA表达明显降低,差异有统计学意、义(P0.05)。1.5 Dex对缺血再灌注大鼠海马组织Bax和Bcl-2表达水平的影响:同假手术组相比,脑缺血再灌注组大鼠海马组织Bcl-2蛋白表达水平显著降低,Bax蛋白表达水平明显上调(P0.01),差异有统计学意义;而Dex干预组大鼠海马组织Bcl-2蛋白表达水平高于缺血再灌注组大鼠(P0.05),Bax蛋白表达水平明显低于缺血再灌注组大鼠(P0.01)。1.6 Dex对缺血再灌注大鼠海马组织中NF-kBp65蛋白阳性表达的影响:脑缺血再灌注组大鼠海马CA1区NF-kBp65蛋白阳性表达细胞明显多于假手术组(P0.01);Dex干预组大鼠海马CA1区NF-kBp65蛋白阳性表达细胞明显低于脑缺血再灌注组大鼠(p0.01)。1.7 Dex对缺血再灌注大鼠海马组织p-Akt蛋白表达水平的影响:与假手术组比较,缺血再灌注组大鼠海马组织中p-Akt蛋白表达水平明显降低(P0.01);Dex干预组大鼠海马中p-Akt蛋白表达水平显著上调,是缺血再灌注组大鼠的2.7倍,差异有统计学意义(P0.01)。第二部分:PI3K/Akt和NF-κ B通路介导右美托咪定对抗OGD/R诱导海马神经元损伤的机制研究目的:体外细胞实验探究PI3K/Akt/NF-κ B通路是否介导Dex对IRI的神经保护作用。方法:取生后24h内SD乳鼠海马进行体外原代海马神经元细胞培养7d,氧糖剥夺复氧复糖再灌注(OGD/R,Oxygen and glucose deprivation/Reperfusion)建立缺血再灌注损伤神经元细胞模型,并给予Dex、LY294002(PI3K/Akt阻断剂)预处理干预。正常对照组(正常培养液及氧浓度培养)、OGD/R组(氧糖缺失2h复氧复糖 12h)、D10+OGD/R组(OGD/R前在培养液中加入 10μ M Dex)、LY+D10+OGD/R组(OGD前60min在培养液中加入20μ M LY294002,OGD同时再给予10μ M Dex共同孵育),分别给予不同处理。倒置相差显微镜观察原代培养海马神经元细胞形态;CCK-8法检测细胞活性;AnnexinVFITC/PI双染流式细胞仪检测各组海马神经元细胞凋亡率;Western Blot法检测海马神经元细胞中Bcl-2、Bax、NF-κ Bp65、Iκ Ba、p-Iκ Ba及总Akt和p-Akt的蛋白表达水平。结果:2.1海马神经元各期形态和纯度检测:倒置相差显微镜观察体外培养的原代海马神经元细胞,培养30min时海马神经元为圆形或椭圆形,分散均匀分布。培养20小时后绝大部分细胞均以贴壁状态存在,细胞呈梭形、三角形或多角形,部分长出突起。培养3d后海马神经元细胞体积增大呈梭形或不规则形状,胞浆较丰富,突起延长。培养至7d时,神经元形态饱满,胞质丰富,突触更长、更粗,突触之间互相连接形成网状结构。对培养7d的海马神经元细胞采用FITC-标记的MAP2抗体免疫荧光染色检测海马神经元细胞纯度为91.8%。2.2不同处理对海马神经元细胞活性的影响:体外培养7d的海马神经元,氧糖缺失2h复氧复糖12h后,细胞活性明显下降,神经元生存率达46.3±8.2%,与正常对照组(100%)相比差异显著(P0.01);10μ M Dex干预使OGD/R海马神经元细胞活性增加到79.8±7.3%(P0.01);与Dex干预OGD/R组相比较,LY294002干预明显抑制了 Dex对海马神经细胞活性的保护作用,LY+D10+OGD/R组细胞活性降为41.8±4.1%(P0.01);与正常对照组相比,在无OGD/R处理情况下,培养基中加入10uM的Dex和20uM的LY294002对体外培养的海马神经元细胞活性均无明显影响。2.3不同处理组海马神经元细胞凋亡率检测:与正常对照组相比,OGD/R组海马神经元细胞凋亡率显著上升(P0.01);与OGD/R组相比,Dex干预组细胞凋亡率明显下降(P0.01);而给予LY294002和Dex共同干预的OGD/R组海马神经细胞凋亡率明显高于单纯Dex干预的OGD/R组(P0.01)。2.4不同处理组海马神经元Bcl-2、Bax蛋白表达水平检测:与正常对照组相比,OGD/R组细胞中Bax蛋白表达水平升高,而Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax比值降低,差异均有统计学意义(P0.01);与OGD/R组比较,Dex干预的OGD/R组Bax蛋白表达水平明显降低,Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax比值明显升高(P0.01);与Dex干预OGD/R组相比,LY294002和Dex共同干预的OGD/R组细胞中Bax蛋白表达水平增加(P0.01),Bc 1-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax比值明显降低(P0.01)。2.5不同处理组海马神经元细胞中NF-κ B信号途径活化的检测:与正常对照组相比较,OGD/R组细胞中NF-κ Bp65蛋白表达及Iκ Ba的磷酸化水平明显升高,而Iκ Ba水平下降(P0.01);与OGD/R组比较,Dex干预组NF-K Bp65及p-IK Ba的蛋白表达水平均明显降低(P0.01),Iκ Ba水平升高(P0.01);而给予LY294002和Dex共同干预的OGD/R组,与Dex干预OGD/R组相比,细胞中NF-K Bp65、IK Ba和p-IkBa表达水平变化不明显(P0.05)。2.6不同处理组海马神经元细胞中PI3K/Akt通路活化的检测:各组海马神经细胞总Akt表达无明显差别。与正常对照组细胞相比,OGD/R组海马神经细胞中Akt蛋白的磷酸化水平降低(P0.05);而Dex干预的OGD/R组细胞中p-Akt蛋白的表达水平显著高于OGD/R组(P0.01);Dex激活Akt的作用可被PI3K抑制剂LY294002完全抑制,LY094002和Dex共同干预OGD/R组神经细胞中p-Akt蛋白表达极低(P0.01)。研究结论1.右美托咪定对缺血再灌注脑损伤具有神经保护作用。2.右美托咪定通过抗炎、抗凋亡机制在缺血再灌注脑损伤中发挥神经保护作用。3.PI3K/Akt和NF-κ B通路参与了右美托咪定抗缺血再灌注脑损伤的神经保护作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614

【参考文献】