成年鼠背毛毛乳头细胞分离方法的建立与评价
发布时间：2020-08-08 22:51
【摘要】：背景:随着组织工程与再生医学的发展,构建组织工程毛囊将会是治疗秃发较有前景的方法。毛乳头细胞(DPCs)是毛囊再生重要的种子细胞。但是,DPCs经体外培养扩增后其诱导能力逐渐丧失。许多方法用于维持或者恢复体外培养的DPCs的诱导能力。但是,短时间内要获取足够数量的且具有诱导能力的DPCs仍比较困难。目前,组织工程毛囊的研究均处于实验阶段,DPCs通常来源于小鼠的触须毛囊或者是手术废弃的人头皮毛囊,其来源非常有限。因此,我们尝试分离并培养小鼠背毛DPCs以期提供一种新的DPCs来源。目的:(1)分离、培养C57小鼠背毛DPCS(2)检测体外培养的C57小鼠背毛DPCs诱导能力(3)探讨培养的背毛DPCs用于毛囊重建的可行性方法:(1)C57小鼠背毛DPCs的分离与培养取5w C57BL/6小鼠背部皮肤,经酶消化及Ficoll密度梯度离心后分离获取毛乳头(DP),显微镜下观察DP外观、贴壁及细胞迁出情况,计算DP贴壁率。观察传代细胞生长情况。(2)体外培养的C57小鼠背毛DPCs诱导能力的检测取P3代的小鼠背毛DPCs、触须DPCs及真皮成纤维细胞(Fbs),分别采用qRT-PCR、免疫荧光。(3)体外培养的背毛DPCs用于毛囊重建分别取P3代小鼠背毛DPCs、触须DPCs及Fbs结合新生鼠上皮细胞用于毛囊重建。分别于移植后4周对移植部位进行组织取材,对移植部位进行大体观察、组织切片HE染色观察。结果:(1)C57小鼠背毛DPCs的分离与培养经酶消化及Ficoll密度梯度离心后获取的DP呈圆形或椭圆形,24h贴壁率达90%。传代后的DPCs呈明显长梭形,漩涡样生长,随着传代次数增加,DPCs逐渐失去凝集性生长能力。(2)体外培养的C57小鼠背毛DPCs诱导能力的检测qRT-PCR、免疫荧光染色检测结果表明:体外培养的小鼠背毛DPCs可表达ALP、β-catenin和Versican在内的与诱导能力相关的细胞标记物基因及蛋白,且与触须DPCs表达无明显差异,与Fbs表达有明显差异。(3)体外培养的背毛DPCs用于毛囊重建将Fbs与新鲜表皮细胞联合移植或者仅表皮细胞单独移植均未能重建出毛囊。将培养的背毛DPCs或者触须DPCs与新鲜表皮细胞联合移植后均能重建出毛囊。结论:(1)通过酶消化结合Ficoll梯度离心法可分离获得小鼠背毛DP,该方法具有高收获率、高分离效率、低劳动强度和高贴壁迁出率的优点;且该方法并未明显影响DPC在体外培养时的细胞形态、生长方式。(2)qRT-PCR、细胞免疫荧光实验结果均证实,体外培养的小鼠背毛DPCs可表达与毛囊诱导能力相关的特异性标记物ALP、β-catenin及Versican,且与触须DP相比并无明显差异。(3)体外培养的小鼠背毛DPCs具有诱导毛囊再生的能力,可用于毛囊重建的实验研究。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R62
【图文】：
体外培养的Ｃ５７小鼠背毛ＤＰＣ呈长梭形，外形与成纤维细胞类似，但有较多逡逑触角伸出。低传代的ＤＰＣ可观察到明显的聚集性生长现象，Ｐ４代以前的毛乳头细逡逑胞聚集性生长现象非常明显（图２ａ），但是随着传代次数的增加，ＤＰＣ聚集性生长逡逑现象逐渐消失，Ｐ６代以后的ＤＰＣ聚集性生长特性不明显（图２ｂ），尤其是Ｐ１０代的逡逑毛乳头细胞生长缓慢可观察到细胞衰老的征象。Ｐ１－Ｐ４代ＤＰＣ生长达８０％融合时，逡逑细胞呈现特有的旋涡状图案（图２ｃ），但是Ｐ６代以后或者更高代数的毛乳头细胞，逡逑其旋涡状生长图案并不明显。逡逑２．３逦ＤＰＣ活力检测逡逑实验中我们对不同代数的ＤＰＣ增殖能力进行了检测，通过ＣＣＫ８法测定了逡逑Ｐ１－Ｐ８代ＤＰＣ的吸光度并绘制呈生长曲线图（图３）。发现各代细胞随着培养时逡逑间的延长，均出现明显X椫诚窒螅坏牵煌南赴湓鲋衬芰浯嬖诓铄义弦欤校炒暗模模校闷湓鲋衬芰ξ廾飨圆钜欤校醇捌湟院蟠南赴湓鲋冲义夏芰γ飨越希校炒郧暗南赴档汀ｅ义希跺义
本文编号：2786222
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R62
【图文】：
体外培养的Ｃ５７小鼠背毛ＤＰＣ呈长梭形，外形与成纤维细胞类似，但有较多逡逑触角伸出。低传代的ＤＰＣ可观察到明显的聚集性生长现象，Ｐ４代以前的毛乳头细逡逑胞聚集性生长现象非常明显（图２ａ），但是随着传代次数的增加，ＤＰＣ聚集性生长逡逑现象逐渐消失，Ｐ６代以后的ＤＰＣ聚集性生长特性不明显（图２ｂ），尤其是Ｐ１０代的逡逑毛乳头细胞生长缓慢可观察到细胞衰老的征象。Ｐ１－Ｐ４代ＤＰＣ生长达８０％融合时，逡逑细胞呈现特有的旋涡状图案（图２ｃ），但是Ｐ６代以后或者更高代数的毛乳头细胞，逡逑其旋涡状生长图案并不明显。逡逑２．３逦ＤＰＣ活力检测逡逑实验中我们对不同代数的ＤＰＣ增殖能力进行了检测，通过ＣＣＫ８法测定了逡逑Ｐ１－Ｐ８代ＤＰＣ的吸光度并绘制呈生长曲线图（图３）。发现各代细胞随着培养时逡逑间的延长，均出现明显X椫诚窒螅坏牵煌南赴湓鲋衬芰浯嬖诓铄义弦欤校炒暗模模校闷湓鲋衬芰ξ廾飨圆钜欤校醇捌湟院蟠南赴湓鲋冲义夏芰γ飨越希校炒郧暗南赴档汀ｅ义希跺义
本文编号：2786222
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