贝沙罗汀在小鼠创伤性脑损伤中的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-08-09 02:27

【摘要】：目的创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)会引起组织丢失和严重的神经功能障碍,目前几乎没有有效的治疗方法。大脑由灰质和白质组成,而灰质主要由神经元的胞体、突触和星形胶质细胞构成,白质主要由神经纤维和外面包裹的少突胶质细胞形成的髓鞘构成。TBI不仅造成神经元和突触损害,还能引起轴突损伤和少突胶质细胞死亡。星形胶质细胞和小胶质细胞在TBI后发挥重要作用,但调节它们的分子机制目前仍不十分清楚。有研究报道,A1型星形胶质细胞是一种有害的星形胶质细胞表型,可以诱导神经元死亡和突触丢失,可以被小胶质细胞分泌的细胞因子激活。白质损伤的修复也受到小胶质细胞极化的影响。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)是一种核内转录因子,可以调控小胶质细胞极化。维甲酸X受体(retinoid X receptor,RXR)是一种核内受体,可以和PPARγ组成异二聚体,调控靶基因功能。贝沙罗汀是一种高选择性的RXR激动剂,T0070907是一种选择性的PPARγ抑制剂,均可以通过血脑屏障。本研究通过建立小鼠TBI模型,给予贝沙罗汀并检测其对大脑皮层和海马所代表的灰质以及胼胝体、内囊和外囊代表的白质的保护作用,并探讨其对星形胶质细胞表型、小胶质细胞极化的影响,探究PPARγ参与的相关机制。方法1、C57BL/6J小鼠72只随机分为四组:假手术组(n=18)、安慰剂组(n=18)、贝沙罗汀组(n=18)、贝沙罗汀+T0070907组(n=18)。采用控制性皮质损伤(controlled cortical impact,CCI)法建立小鼠TBI模型。CCI后每天腹腔注射贝沙罗汀或安慰剂、PPARγ的拮抗剂T0070907和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)。神经损伤严重程度评分(neurological severity scores,NSS)和水迷宫实验验证贝沙罗汀对TBI后小鼠的感觉运动功能和学习记忆功能的影响。建模后14天免疫荧光检测神经元存活和突触密度,检测轴突再生、髓鞘完整性和少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)的数量。Western blot检测突触前蛋白标记物synaptophysin和突触后蛋白标记物突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)的表达,检测生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP43)和髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达。2、C57BL/6J小鼠180只随机分为四组:假手术组(n=41)、安慰剂组(n=49)、贝沙罗汀组(n=49)、贝沙罗汀+T0070907组(n=41)。采用CCI法建立小鼠TBI模型。CCI后每天腹腔注射贝沙罗汀或安慰剂或T0070907。免疫荧光检测A1型星形胶质细胞数量和cleaved caspase-3阳性细胞数,检测M1型小胶质细胞的数量和M2型小胶质细胞的数量以及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表达。Western blot检测A1型星形胶质细胞标志物表达、凋亡相关蛋白的表达、小胶质细胞来源的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)、补体成分1q亚单位α链(complement component 1 q subcomponentαchain,C1qα)和BNDF的表达、M1型小胶质细胞标志物的表达和M2型小胶质细胞标志物的表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测小胶质细胞来源的TNF-α、IL-1α和C1qα的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)水平,检测M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞标志物的mRNA水平。Western blot检测RXRα和PPARγ的核转位,转录活性试验检测PPARγ依赖的转录,探讨贝沙罗汀影响小胶质细胞极化的作用机制。3、C57BL/6J小鼠45只随机分为PBS组(n=9)、IgG组(n=9)、TNF-α中和抗体(anti-TNF-α)组(n=9)、IL-1α中和抗体(anti-IL-1α)组(n=9)和C1qα中和抗体(anti-C1qα)组(n=9)。采用CCI建立小鼠TBI模型,侧脑室注射TNF-α中和抗体、IL-1α中和抗体、C1qα中和抗体、PBS或IgG。免疫荧光检测A1型星形胶质细胞数量,Western blot检测A1型星形胶质细胞标志物的表达,探讨TNF-α、IL-1α和C1qα对A1型星形胶质细胞的影响。4、C57BL/6J小鼠25只随机分为对照组(n=5)、TBI后第1天组(n=5)、TBI后第3天组(n=5)、TBI后第7天组(n=5)和TBI后第14天组(n=5),采用CCI建立小鼠TBI模型,Western blot检测RXRα和PPARγ分别在总蛋白、胞浆中和核中的表达。结果1、与安慰剂组相比,贝沙罗汀组小鼠感觉运动功能和学习记忆功能明显改善。TBI后14天,贝沙罗汀促进神经元存活,增加突触密度,促进轴突再生,保存髓鞘完整性,促进OPC增殖。T0070907减轻了贝沙罗汀的这些作用。2、与给予安慰剂相比,TBI后14天,贝沙罗汀组A1型星形胶质细胞数量明显减少,细胞凋亡明显减少,小胶质细胞来源的TNF-α、IL-1α和C1qα表达的表达明显降低,M1型小胶质细胞极化减少,M2型小胶质细胞极化增加。小胶质细胞来源的BDNF的表达增加。T0070907部分消除了贝沙罗汀的这些作用。与PBS对照组相比,TNF-α中和抗体组、IL-1α中和抗体组和C1qα中和抗体组的A1型星形胶质细胞数量明显减少。3、TBI后RXRα和PPARγ在胞浆中的表达先降低后升高,在核内的表达先升高后降低。TBI后14天,与安慰剂组相比,贝沙罗汀组RXRα和PPARγ在胞浆中的表达明显降低,在核内的表达明显升高。T0070907没有影响贝沙罗汀对RXRα的作用,但消除了它对PPARγ的作用。TBI后PPARγ的转录活性明显增加。与安慰剂组相比,贝沙罗汀增加了PPARγ的转录活性,而T0070907减轻了贝沙罗汀的这种作用。结论1、贝沙罗汀可以促进小鼠TBI后神经元存活,增加突触密度,促进轴突再生,保持髓鞘完整性,改善神经功能。2、贝沙罗汀的神经保护作用可能与其减少A1型星形胶质细胞数量和促进小胶质细胞从M1型向M2型极化有关。3、贝沙罗汀的作用可能部分通过促进PPARγ的核转位和其依赖的转录。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.15
【图文】：

与假手术小鼠相比，CCI明显增加了小鼠NSS评分。伤后第1天最重，第21天逐渐改善。贝沙罗汀明显改善了小鼠CCI后NSS评分。与贝沙罗汀组相比，贝沙罗汀+T0070907组显示了明显增加的NSS评分（图1.1）。

水迷宫,小鼠,安慰剂,平台

我们进行了水迷宫试验（图1.2）。从CCI后第16天到第20天，CCI小鼠的平台潜伏期比假手术小鼠明显增加。与安慰剂组相比，贝沙罗汀组小鼠的平台潜伏期明显减少（p<0.05）。然而，贝沙罗汀+T0070907组的小鼠的潜伏期明显长于贝沙罗汀组（p<0.05）（图1.3）。与假手术组相比，正确象限所用时间比例在安慰剂组明显降低（p<0.05），而贝沙罗汀明显增加了这一比例（p<0.05）。PPARγ拮抗剂T0070907逆转了贝沙罗汀的这一作用（p<0.05）（图1.4）。在CCI后第21天的探针试验中，与假手术小鼠相比，安慰剂治疗的CCI小鼠穿越平台的次数明显减少（p<0.05），而贝沙罗汀增加了CCI小鼠穿越平台的次数（p<0.05）。用T0070907抑制PPARγ后

小鼠,平台,安慰剂,次数

从CCI后第16天到第20天，CCI小鼠的平台潜伏期比假手术小鼠明显增加。与安慰剂组相比，贝沙罗汀组小鼠的平台潜伏期明显减少（p<0.05）。然而，贝沙罗汀+T0070907组的小鼠的潜伏期明显长于贝沙罗汀组（p<0.05）（图1.3）。与假手术组相比，正确象限所用时间比例在安慰剂组明显降低（p<0.05），而贝沙罗汀明显增加了这一比例（p<0.05）。PPARγ拮抗剂T0070907逆转了贝沙罗汀的这一作用（p<0.05）（图1.4）。在CCI后第21天的探针试验中，与假手术小鼠相比，安慰剂治疗的CCI小鼠穿越平台的次数明显减少（p<0.05），而贝沙罗汀增加了CCI小鼠穿越平台的次数（p<0.05）。用T0070907抑制PPARγ后，小鼠穿越平台的次数较只用贝沙罗汀的小鼠明显减少（p<0.05）（图1.5）。

【参考文献】