间断及持续缺氧扩张条件下真皮层组织学改变规律

发布时间：2020-08-11 19:17

【摘要】：研究背景:皮肤软组织扩张术是整形外科治疗软组织缺损和畸形的一种重要方法。扩张过程中皮肤组织会产生一系列的改变,包括细胞的增殖与凋亡、细胞外基质的合成与降解、新生血管的生成与退化等,在组织的上述改变中起到关键作用的影响因素可能是氧供。扩张过程中,源于扩张囊的压力作用于局部被扩张的组织,使其发生形变、正常血液灌注受到影响,导致被扩张组织产生短暂或持续性的缺氧,在缺氧刺激下,组织会启动修复过程(血管新生与退化、细胞增殖与凋亡、细胞外基质合成与分解),从而恢复组织氧的供应。临床上存在的扩张方式有常规扩张、持续扩张、间断快速扩张、恒压扩张等,在不同扩张方式下,组织的缺氧程度、持续缺氧时间往往存在着明显的差异。由此而造成的成纤维细胞增殖与凋亡、胶原合成与分解、新生血管的生成与退化等生物学特性都会发生相应的改变,最终将直接影响扩张皮肤的质量。本论文的第一部分介绍大鼠间断及持续缺氧皮肤扩张模型构建的实验方法,应用经皮氧分压对扩张组织氧供状态进行监测,并结合缺氧检测试剂对不同程度缺氧扩张条件下的组织标本进行免疫荧光染色,了解组织细胞缺氧状况。结合HE染色观察组织结构变化,证明扩张效果。希望能为扩张术的基础研究提供一个成熟、稳定的皮肤软组织缺氧扩张动物模型。本论文的第二部分介绍间断及持续缺氧扩张条件下皮肤真皮层组织学改变规律。对大鼠正常皮肤、间断及持续缺氧扩张皮肤标本行HE染色,光镜下观察各组皮肤组织学形态,并测量各组真皮厚度;通过Masoon染色,测量真皮层单位面积胶原含量变化;通过PCAN及TUNEL染色,了解两种缺氧扩张条件下真皮成纤维细胞的增殖及凋亡情况;行CD31染色,观察真皮层血管形态及密度的改变。进而探讨不同缺氧扩张条件下真皮层的组织学改变规律,了解维持不同缺氧条件扩张,是否能有效的诱导真皮层组织结构改建,是否会对组织有损害作用,进而为临床上寻找合适的扩张方式提供实验依据。第一部分大鼠间断及持续缺氧皮肤扩张模型的构建目的:构建大鼠背部间断缺氧(Intermittent hypoxia,IH)及持续缺氧(Persistent hypoxia,PH)皮肤软组织扩张模型,为皮肤软组织扩张术的基础研究提供稳定的动物模型。方法:将16只体重200-250g的SD大鼠分为持续缺氧扩张组(IH组)及间断缺氧扩张组(PH组),每组8只,每只大鼠背部近尾端肉膜层下置入1枚10 ml容量皮肤软组织扩张器。IH组及PH组扩张过程中监测经皮氧分压,通过注水调节,维持扩张皮肤处于持续或间断缺氧状态,扩张结束后采集各组扩张区域中央皮肤组织标本,行HE染色,镜下观察皮肤结构变化;应用组织缺氧探针(Hypoxyprob-1)免疫荧光染色,并对各组真皮层缺氧成纤维细胞及总成纤维细胞计数,计算缺氧细胞比率。结果:持续或间断缺氧扩张过程中动物耐受良好、注水过程顺利、无感染及皮肤坏死;组织切片HE染色后镜下观察见持续和间断缺氧组扩张后皮肤表皮层较正常皮肤组明显增厚,真皮层均变薄;扩张过程中实验组经皮氧分压水平维持状况稳定;组织缺氧探针免疫荧光染色结果提示,正常皮肤组织标本中未检测到缺氧阳性真皮成纤维细胞,扩张后组织缺氧阳性真皮成纤维细胞显著增加,持续缺氧扩张组较间断缺氧扩张组缺氧阳性真皮层成纤维细胞比率高。间断及持续缺氧扩张组之间组织缺氧程度差异明显,能够实现间断缺氧及持续缺氧扩张。结论:该动物模型有良好的稳定性及可重复性,符合医学动物模型制作的要求,此模型可用于间断缺氧及持续缺氧扩张条件下真皮组织学变化规律的研究。第二部分间断及持续缺氧扩张条件下皮肤真皮层组织学改变规律目的:研究皮肤软组织扩张过程中,间断缺氧及持续缺氧扩张后皮肤真皮层组织学改变规律。方法:选择持续缺氧扩张、间断缺氧扩张皮肤及正常皮肤标本,行HE染色,光镜下观察真皮层结构变化,应用显微标尺测量HE染色切片中各组皮肤真皮层的厚度并在高倍镜下行毛囊计数;Masson染色了解真皮层胶原含量变化,并应用病理图像分析软件对染色标本进行平均灰度定量分析,以量化各组标本中胶原纤维含量;应用增殖细胞核抗原(PCAN)染色,测定真皮成纤维细胞增殖情况;应用TUNEL染色,测定真皮成纤维细胞凋亡情况;CD31染色,了解真皮层血管形态及密度变化。结果:间断及持续缺氧扩张后皮肤真皮层均变薄,毛囊稀疏,胶原增粗,排列方向趋于整齐。正常皮肤每高倍视野毛囊数为6.05±0.94个,IH组每高倍视野毛囊数为3.50±0.62个,PH组每高倍视野毛囊数为3.30±0.78个。扩张后组织真皮层每高倍视野下毛囊个数明显减少,但IH组和PH组统计结果无显著差异(P0.05);对各组标本真皮层厚度进行测量,结果提示:IH组真皮厚度为500.2±22.57μm,PH组为464.3±27.23μm,正常皮肤组为759.4±27.23μm。IH组及PH组真皮层均较正常皮肤变薄,其中PH组较IH组明显变薄,其差异有统计学意义(P0.05)。各组标本Masoon染色,并对真皮层内代表胶原纤维的蓝色像素值进行统计,结果提示:正常皮肤组像素值平均为199769±6027 pixels;IH组像素值平均为257557±4648 pixels,PH组像素值平均为220401±7298 pixels,IH组及PH组均较正常皮肤真皮层单位面积胶原含量增高,且IH组较PH组增高明显,两组数值差异有统计学意义(P0.05)。正常皮肤真皮层PCNA阳性成纤维细胞的细胞密度为6.1个/高倍视野,IH组为19.38个/高倍视野,PH组为个15.82/高倍视野,IH组PCNA阳性细胞较PH组高,两组数值差异有统计学意义(P0.05)。TUNEL染色结果提示,正常皮肤真皮成纤维细胞凋亡细胞密度为5.1个/高倍视野,IH组为16.05个/高倍视野,PH组为13.05个/高倍视野。IH组TUNEL阳性成纤维细胞密度较PH组升高,但两组数值差异无统计学意义(P0.05)。CD31对各组皮肤标本行组织化学染色,并在高倍镜下对真皮层血管进行计数,结果提示:间断缺氧扩张组每高倍视野毛细血管平均值为22.87±1.13个,持续缺氧扩张组为13.57±0.43个,两组数值差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.扩张后皮肤真皮层单位面积内毛囊计数较正常皮肤减少,可能与皮肤牵拉后皮肤附件的间距增加有关。2.间断缺氧扩张组真皮层厚度大于持续缺氧扩张组,且单位面积内胶原含量较持续缺氧组高,这与间断缺氧扩张更有效的刺激真皮成纤维细胞增殖、降低细胞凋亡、促进胶原合成有关。间断缺氧扩张组真皮层新生血管密度较持续缺氧扩张组明显增加,说明间断缺氧能够更有效促进真皮血管网的重构,为扩张组织提供更多氧气及营养物质。3.间断缺氧扩张更有利于扩张皮肤的生物性生长,为临床修复重建提供更多材料。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R622
【图文】：

图 1.大鼠背部扩张器置入 a、b.术前设计 c.扩张器置入后即刻 d.术后 1 周(注水10ml)Fig 1. Expander implant surgery a、b. Preview design c. Postview at once oexpander implant d. Postview at 1 week ( injected saline 10ml )2.2 经皮养分压检测方法及原理皮肤的经皮氧分压用瑞典 PERIMED AB 公司生产的 Perifux 5000 系统的经皮氧分压（TcpO2）模块进行检测。临床上，经皮氧分压常用于监测人体全身呼吸或局部的血流灌注情况。其原理是经皮氧分压监测探头通过对局部皮肤进行加热，致使该部位毛细血管扩张，受热区域血液中的氧气通过皮肤透出进入接触液，探头监测接触液中氧浓度，由此反映从毛细血管透过表皮弥散出来的氧气的含量。2.2.1 经皮养分压检测操作步骤1) 在经皮氧分压监测开始前需先行系统校准，Perifux5000 系统的电极（探头）采

图 2 经皮氧分压监测设备 a. 经皮氧分压监测探头（▲） b. 经皮氧分压监测仪Fig 2 Transcutaneous oxygen monitoring equipment a. Transcutaneous oxygemonitoring probe (▲) b. Transcutaneous oxygen monitor2.2.2 扩张皮瓣经皮氧分压监测临界值选择扩张器置入术后 1 周开始注水扩张。扩张过程中根据经皮氧分压的监测情况判断皮肤缺氧状态，同时在注水扩张过程中应确保扩张皮肤中央的血液供应处于安全范围内，否则将会导致皮肤缺血坏死、扩张器外露等并发症，使模型构建成功率下降。根据既往文献报道，扩张过程中当囊内压< 8kPa（约 60mmHg）时，扩张皮瓣微循环未被阻断，皮瓣血运相对安全[53-54]。在预实验（体内试验）中发现，在扩张器持续注水扩张过程中，扩张囊内总注水量达 25ml 左右时，扩张器囊内压可达 8kPa,此时经皮氧分压平均值为 1.4±0.25mmHg(图 4)。首次注水使扩张囊总容量达 25ml 后维持注水量不变，持续经皮氧分压监测，发现经皮氧分压在 24 小时内可维持在

图 3 持续注水扩张囊内压监测（体内）Fig 3 Measureing the internal pressure of expander during expansio张皮瓣经皮氧分压监测及扩张器注水方法断缺氧扩张组：注水过程中监测经皮氧分压，当经皮氧分压下降<3水，监测氧分压变化，待经皮氧分压恢复或接近未扩张前皮肤经皮再次注水，使经皮氧分压下降<3mmHg，如此反复扩张。扩张囊内总停止注水。续缺氧扩张组：注水时监测经皮氧分压，当经皮氧分压下降<3mmH并持续监测经皮氧分压，当经皮氧分压接近 3mmHg 时再次注水，使维持在 1-3mmHg 之间。扩张囊内注水总量约 70ml 后停止注水。织标本的采集与处理到预定扩张量后进行取材，取材部位位于扩张皮肤区域中心，取材前

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本文编号：2789459