STAT3介导CX3CL1上调在SMIR诱导术后慢性疼痛中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-13 00:56

【摘要】：[研究目的]外科手术后常常继发术后慢性疼痛,严重影响患者的生活质量。近年来研究显示,CX3CL1在神经损伤引起的神经病理性疼痛中发挥重要作用,然而CX3CL1是否参与术后慢性疼痛并不清楚。本研究采用大鼠皮肤肌肉切口牵拉(skin/muscle incision and retraction,SMIR)模型模拟术后慢性疼痛,探讨CX3CL1是否参与SMIR诱导的痛觉过敏以及其机制。[研究方法]一、研究SMIR术后大鼠脊髓背角CX3CL1表达情况及CX3CL1是否参与SMIR诱导的机械性痛觉过敏首先行SMIR术并检测SMIR术前及术后第1、5、10、20天大鼠手术同侧和对侧的50%机械撤足阈值(paw withdrawal threshold,PWT);SMIR术前30min直至术后第10天每天一次或SMIR术10天后已产生显著机械性痛觉过敏的情况下再连续5天每天一次鞘内注射CX3CL1中和性抗体,分别检测大鼠术侧PWT变化;分别取空白对照组、SMIR术后第1、5、10、20天大鼠术侧脊髓背角,进行westernblot和实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测 CX3CL1 的蛋白和 mRNA 表达水平;分别取空白对照组、单纯SMIR组及SMIR+CX3CL1 antibody组大鼠脊髓,免疫荧光检测小胶质细胞标记物Ibal在脊髓背角的荧光信号强度;SMIR术后第10天取大鼠脊髓,免疫荧光检测CX3CL1在脊髓背角的表达部位。二、检测SMIR是否激活大鼠脊髓背角STAT3及STAT3是否介导了 CX3CL1的上调和痛觉过敏SMIR术后第10天取大鼠脊髓,免疫荧光检测p-STAT3在脊髓背角的表达部位以及CX3CL1和p-STAT3是否存在共定位;分别取空白对照组、SMIR术后第1、5、10、20天大鼠术侧脊髓背角,进行western blot检测总的STAT3和p-STAT3的蛋白表达水平;SMIR术前30min至术后第10天,每天一次鞘内注射STAT3磷酸化抑制剂S3I-201,检测大鼠术侧PWT变化;将大鼠分为三组,一组为空白对照组,一组单纯行SMIR手术,还有一组行SMIR手术且预先鞘内注射S3I-201直至术后第10天,western blot检测三组大鼠术侧脊髓背角p-STAT3和CX3CL1的蛋白表达水平,qPCR检测三组大鼠术侧脊髓背角CX3CL1 mRNA表达水平。三、探讨SMIR是否促进转录因子STAT3和cx3cl1基因启动区域的结合将大鼠分为SMIR组和空白对照组,对术侧脊髓背角进行染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验,用 STAT3 抗体将可能与之结合的 DNA 片段拉下来,再进行实时荧光定量PCR和半定量PCR检测。[结果]一、脊髓背角CX3CL1上调参与SMIR诱导的机械性痛觉过敏SMIR术后第5天开始出现显著的机械性痛觉过敏并维持到术后第20天。预先鞘内注射CX3CL1中和性抗体能显著缓解SMIR诱导的机械性痛觉过敏,而对SMIR术后已产生显著机械性痛觉过敏的大鼠再鞘内注射CX3CL1中和性抗体则不能缓解已产生的痛觉过敏。SMIR术后第5、10、20天,术侧脊髓背角CX3CL1蛋白和mRNA表达水平与空白对照组相比显著上调。免疫组化结果显示,SMIR显著激活脊髓背角小胶质细胞,而鞘内注射CX3CL1中和性抗体能抑制小胶质细胞的激活。且SMIR术后,脊髓背角上调的CX3CL1表达在脊髓背角神经元上但不表达在星形胶质细胞和小胶质细胞上。二、STAT3介导了 SMIR诱导的脊髓背角CX3CL1的上调和机械性痛觉过敏SMIR术后,p-STAT3也主要表达在脊髓背角神经元上但不表达在星形胶质细胞和小胶质细胞上,且CX3CL1和p-STAT3存在大量共定位。SMIR术后第5、10、20天,术侧脊髓背角STAT3磷酸化水平显著上调。预先鞘内注射STAT3磷酸化抑制剂S3I-201能显著缓解SMIR诱导的机械性痛觉过敏,并能抑制SMIR术后脊髓背角p-STAT3和CX3CL1蛋白水平的上调,CX3CL1在mRNA水平的上调同样受到抑制。三、SMIR可促进转录因子STAT3和cx3cl1基因启动区域的结合和空白对照组相比,ChIP结果表明SMIR可促进转录因子STAT3和cx3cl1基因启动区域的结合。[结论]SMIR术后,大鼠脊髓背角CX3CL1上调并参与SMIR诱导的机械性痛觉过敏,STAT3激活并介导了 CX3CL1的上调和痛觉过敏,这可能是由于SMIR上调了 STAT3和cx3cl1基因启动区域的结合进而促进了 CX3CL1的转录。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614
【图文】：

结果逡逑髓背角ＣＸ３ＣＬ１上调参与ＳＭＩＲ诱诱导产生持续的机械性痛觉过敏逡逑模型，并在术前、术后］天、５天、１０天、％机械撤足阈值（ＰＷＴ邋），同批未行ＳＭＩＲ值相比，ＳＭＴＲ能够引起术侧产生显著的侧痛阈尚无明显改变，术后第５天，术侧５术后２０天。手术对侧５０％ＰＷＴ无明显变化－－

ＳＴＡＴ３介导ＣＸ３ＣＬ１上调在ＳＭＩＲ诱导术后慢性疼痛中的作用及机制研究逡逑到缓解，与单纯行ＳＭＩＲ相比，ＰＷＴ没有统计学差异，而与未行ＳＭＩＲ的对照组相逡逑比，ＰＷＴ明显降低（图２－Ｂ），提示ＣＸ３ＣＬ１可能并不参与ＳＭＩＲ诱导的痛觉过敏的逡逑维持。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑一邋－ｅ－邋ＳＭＩＲ逦千邋Ｃｏｎ逦＾逦－ｅ－邋ＳＭＩＲ逦－ｙ－邋Ｃｏｎ逡逑＾■３５－｜邋ＳＭＩＲ邋＋邋Ａｎｔｉｂｏｄｙ逦＾邋３５＿｜邋－＊■邋ＳＭＩＲ邋＋邋Ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑ｏ邋３０－逦0邋３０－逡逑ｊ：逦ｊ：逡逑傮邋0■逦Ａｎｔｉｂｏｄｙ逦逦，0＿逦Ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑ｒａ邋－５邋ｉ逦１逦１逦１逦１逦１逦ｔｏ邋－５」邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ逡逑Ｑ－逦0邋１逦５逦１０逦１５逦２０逦０逦１逦５逦１０逦１５逦２０逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｄａｙ）逦Ｔｉｍｅ邋（ｄａｙ）逡逑图２鞘内注射ＣＸ３ＣＬ１中和性抗体对ＳＭＩＲ诱导痛觉过敏的影响。（Ａ）预先鞘内注逡逑射ＣＸ３ＣＬ１中和性抗体直至术后第１０天可缓解ＳＭＩＲ诱导的机械性痛觉过敏（ｎ＝６，逡逑＊＝？＞＜０．０１，＊＝＞＜０．００１邋与邋ＳＭＩＲ邋组相比）。（Ｂ）邋ＳＭＩＲ邋术后邋１０邋天后鞘内给予邋ＣＸ３ＣＬ１逡逑中和性抗体连续５天对大鼠己产生的机械性痛觉过敏无缓解作用（ｎ＝６，邋＾＜０．０１，逡逑＿ｐ＜０．００１与Ｃｏｎ组相比）逡逑３、ＳＭＩＲ诱导脊髓背角ＣＸ３ＣＬ１显著上调并参与小胶质细胞的激活逡逑行为学结果提示ＣＸ３ＣＬ１参与ＳＭＩＲ诱导痛觉过敏的形成，进一步行实时荧光逡逑定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）结果显示

行为学结果提示ＣＸ３ＣＬ１参与ＳＭＩＲ诱导痛觉过敏的形成，进一步行实时荧光逡逑定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）结果显示，与对照组相比，ＳＭＩＲ术后第５天，脊髓背角ＣＸ３ＣＬ１逡逑在ｍＲＮＡ水平显著上升，并维持到术后第２０天（图３－Ａ）。又行ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ检测，逡逑结果与ＰＣＲ相一致，ＳＭＩＲ诱导脊髓背角ＣＸ３ＣＬ１蛋白水平也显著上调（图３－Ｂ）。逡逑另外，免疫荧光组织化学结果显示，与对照组相比，ＳＭＩＲ诱导脊髓背角小胶质细胞逡逑激活，小胶质细胞标记物Ｉｂａｌ荧光信号强度增强，而预先鞘内给予ＣＸ３ＣＬ１中和性逡逑抗体后，ＳＭＩＲ诱导小胶质细胞的激活受到明显抑制，Ｉｂａｌ荧光信号强度与ＳＭＩＲ组逡逑相比显著降低（图３－Ｃ），提示上调的ＣＸ３ＣＬ１参与ＳＭＩＲ诱导的小胶质细胞的激活。逡逑－２５－逡逑

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本文编号：2791275