【摘要】：背景部分肝切除手术(PHx)是原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)和肝硬化等终末期肝脏疾病常用的治疗手段。部分肝切除手术后,机体的代谢反应会发生明显的改变以适应术后肝再生的能量需求。过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)是以调节脂肪酸氧化为主要功能的核受体,同时,很多研究也表明PPARα也是潜在的促有丝分裂因子。尽管已有报道显示整体敲除PPARα基因后可减弱PHx后的肝再生能力,但是其具体作用机制仍不明确,我们之前的研究表明特异性敲除肝细胞的PPARα可抵消PPARα激动剂Wy14643诱导的细胞增殖效应,而敲除髓样细胞PPARα则没有类似作用,这提示机体不同细胞上PPARα的表达对肝再生的影响是不同的,本课题拟应用肝细胞特异性敲除PPARα小鼠,研究肝细胞PPARα在PHx诱导肝再生中作用,并探讨其作用机制。目的研究肝细胞PPARα在PHx术后肝再生中的作用及其机制。方法1.采用肝细胞特异性PPARα敲除小鼠即Ppara~(△Hep)小鼠和同窝对照小鼠Ppara~(fl/fl)小鼠行2/3PHx手术。2.小鼠在取材前两小时腹腔注射(5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU)(5 mg/ml,50mg/kg体重)使BrdU掺入增殖的细胞内,以便于后续的染色。取材后的肝组织固定于10%甲醛溶液中24小时后,进行脱水和石蜡包埋,切片(4μm)后进行BrdU染色。通过计算BrdU阳性率(BrdU~+肝细胞数/肝细胞总数)来比较不同组别小鼠肝脏再生的水平。3.部分石蜡切片用于苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色对肝脏的病理改变进行观察。4.部分石蜡切片用于糖原PAS染色,对肝脏糖原含量的变化进行检测。5.留取部分肝组织进行冰冻切片,通过油红O染色检测肝脏脂质积累的情况。6.应用实时定量PCR技术(q-PCR)对不同组别小鼠肝脏基因mRNA水平的变化进行检测。7.应用蛋白免疫印记技术(Western blot,WB)定量检测不同组别小鼠肝脏组织中与细胞增殖相关蛋白如增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)及PPARα蛋白的表达情况。结果1.2/3肝切除模型构建成功我们首先对WT小鼠进行2/3肝切除手术,在PHx后不同时间点取材,qPCR实验显示PHx术后小鼠肝脏CyclinD1(Ccnd1)的mRNA水平在术后24、32和40h明显高于Sham组小鼠。通过Brd U染色统计PHx-40h和Sham-40h BrdU阳性率,该结果与已有报道一致,说明2/3肝切除模型构建成功。2.WT小鼠PHx后12和32 h肝脏PPARα的蛋白水平比Sham组明显升高Western blot实验结果显示,与Sham组相比PHx术组小鼠在术后12和32h肝脏PPARα的蛋白水平明显升高。3.肝细胞PPARα特异性敲除小鼠的敲除效率验证应用qPCR和Western blot方法对肝细胞特异性PPARα敲除小鼠的敲除效率进行验证,结果显示敲除效率达90%以上,说明转基因小鼠敲除成功,符合实验要求。4.肝细胞PPARα特异性敲除小鼠PHx后肝再生能力减弱与Ppara~(fl/fl)小鼠相比,HE染色和BrdU免疫组化染色结果显示PHx术后32小时,Ppara~(△Hep)小鼠肝脏有丝分裂指数和BrdU阳性率明显降低,并且肝重/体重比在术后32 h也有明显降低,提示肝脏PPARα可以促进PHx后的肝细胞增殖。5.肝细胞PPARα特异性敲除小鼠PHx后细胞周期相关基因表达下降qPCR和Western blot实验结果显示,与对照组相比,PHx后12、24和32小时Ppara~(△Hep)小鼠Ccnd1的mRNA水平明显降低;PHx后32小时Pcna的mRNA水平与对照组相比明显降低。Western blot实验结果显示CyclinD1和PCNA的蛋白水平变化趋势与mRNA水平一致。6.肝细胞特异性敲除PPARα降低小鼠DNA损伤修复相关基因的表达q-PCR结果显示PHx-24小时,Ppara~(△Hep)小鼠DNA损伤修复相关基因,如Chek1,Mcm2/5,Prkdc和Rad51的mRNA水平与对照组相比明显降低,说明肝细胞PPARα对PHx后肝细胞DNA损伤的修复也起到了促进作用。7.肝细胞特异性敲除PPARα促进小鼠肝脏脂质堆积肝脏油红O染色和肝脏甘油三酯含量检测结果均显示Ppara~(△Hep)小鼠肝脏脂质堆积增加,qPCR结果显示PHx后6小时或12小时,Ppara~(△Hep)小鼠肝脏脂肪酸氧化相关基因的表达较对照组也有明显下降。8.肝细胞特异性敲除PPARα促进小鼠肝脏糖原积累糖原PAS染色和肝脏糖原含量检测结果显示Ppara~(△Hep)小鼠肝脏糖原含量增加,伴随着糖异生和糖酵解水平的降低。结论肝脏PPARα可通过调节细胞周期相关基因的表达,增加肝脏脂质代谢和葡萄糖代谢来满足肝再生过程中大量的能量需求,进而促进肝再生。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R657.3
【参考文献】
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本文编号：
2792472
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