右美托咪定对LPS诱导急性肺损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-08-21 13:07

【摘要】：ALI/ARDS是由多种致病诱因引发的,以进行性呼吸困难和顽固性低氧血症为主要特征的机体急性过度炎症反应综合征。近年来,由于空气污染及人类生活习惯的转变,ALI/ARDS的发病率日趋增高,是严重创伤、重症感染、手术麻醉等多种临床案例的并发症。ALI已严重影响患者呼吸系统、生活质量甚至危及生命,因此ALI患者应及时进行机械通气治疗。研发抗急性肺损伤药物,提升病患生活质量,降低患者死亡率,成为亟待解决而任重道远的课题。ALI本质上是呼吸道及肺组织中的失控性炎症反应。在急性肺损伤的最初炎症病理反应阶段,革兰阴性细菌感染是常见的致病因素。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是ICU、手术室中发生感染的常见致病因素。LPS的滴鼻诱导可有效模拟急性肺损伤的发病过程,是广泛应用的动物模型。LPS可刺激多种炎性细胞,致使大量炎症介质释放,加速ALI病情的恶化。故遏制炎性细胞过度激活及炎症因子的释放是改善ALI/ARDS病情发展的关键。右美托咪定已广泛应用于ICU和临床麻醉工作。大量证据表明右美托咪定能够缓解急性肺损伤病情,但其作用机制尚不完全清楚。高迁移率族蛋白1(high mobility group box-l protein,HMGBl)是高迁移率族(HMG)蛋白家族成员,能够参与多种下游靶标和基因转录过程的调控。HMGBl起到炎症反应的枢纽作用。甘草酸(Glycyrrhizin)是中药甘草中提取的主要有效成分,也是常用的HMGBl天然抑制剂,本课题拟以右美托咪定为研究对象,采用动物模型及体外不同种属来源细胞模型,阐述HMGBl介导的TLR4/MyD88/NF-κB通路和PI3K/Akt/mTOR通路在急性肺损伤发病进程中的调节作用与机制。1.右美托咪定对LPS诱导大鼠急性肺损伤的保护作用目的:本章旨在从抗炎和抗氧化途径探究右美托咪定对LPS致大鼠急性肺损伤的保护作用及机制。方法:随机将SD大鼠分为正常对照组、LPS组、LPS+地塞米松(Dexamethasone,DXM,2 mg/kg)组、LPS+DEX(12.5μg/kg)组、LPS+DEX(50μg/kg)组和LPS+DEX(50μg/kg)+甘草酸(Glycyrrhizin)组。给SD大鼠连续3天腹腔注射DXM(2mg/kg)或DEX(12.5μg/kg,50μg/kg),正常对照组和LPS组同时腹腔注射给予等体积溶媒。1 h后给LPS+DEX(50μg/kg)+甘草酸组大鼠腹腔注射甘草酸(50mg/kg)。在甘草酸组注射结束1h后,滴鼻给予200μl LPS(8 mg/ml)构建急性肺损伤模型,正常对照组同时滴鼻给予200μl PBS,6 h后处死大鼠。考察肺组织中过氧化物酶(MPO)活性,血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力;用ELISA试剂盒测定BALF、血清和肺组织中炎症因子白介素(IL)-6、IL-1β及肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平;HE染色观察肺组织的病理变化;应用免疫组化分析肺组织中HMGB1的表达以及用western blot法检测TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的变化。结果:DEX显著缓解了LPS刺激所引起的肺组织病理学改变,并且降低了大鼠BALF、血清和肺组织中IL-6、IL-1β及TNF-α的含量,提高血清中SOD、GSH-Px的活性,降低MPO活力和MDA含量。通过Western blot检测发现DEX能明显下调肺组织中HMGB1、TLR4、MyD88、p-IκBα、p-NF-κB、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达。免疫组化染色结果亦显示DEX明显下调HMGB1表达。同时,通过HMGB1抑制剂甘草酸的应用证实了DEX改善急性肺损伤的作用机制与HMGB1通路有关。结论:DEX可以通过抗炎和抗氧化效应有效改善LPS诱导的大鼠急性肺损伤,其作用机制可能与HMGB1介导的TLR4/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路相关。2.右美托咪定对LPS诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B的保护作用目的:本章旨在研究右美托咪定对LPS诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B的保护作用并探究其机制。方法:BEAS-2B细胞被随机分为7组:正常对照组,LPS组,LPS+glycyrrhizin组,LPS+DEX(5μM)组,LPS+DEX(10μM)group组,LPS+DEX(20μM)group组和LPS+DEX(20μM)+glycyrrhizin组。细胞用DEX(5,10,and 20μM)进行预处理1小时,细胞与glycyrrhizin(20μM)再孵育1小时后加入LPS(4μg/ml)。24小时后,收集细胞和上清液进行检测。Griess法检测NO含量;MTT法检测细胞活力;ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量;检测细胞中SOD和GSH-Px活性以及MDA含量;Western blot法检测细胞中HMGB1、TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达;免疫荧光分析细胞中HMGB1的表达情况。结果:DEX(5,10,and 20μM)能显著抑制NO生成;减少上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平;降低了MDA含量,增强了SOD和GSH-Px的活性。DEX能有效下调HMGB1、TLR4和MyD88的表达,抑制IκBα、NF-κB、PI3K、Akt和mTOR磷酸化;DEX联合HMGB1抑制剂甘草酸作用时抑制作用更显著。免疫荧光染色结果亦显示DEX能明显抑制BEAS-2B中HMGB1的表达。结论:DEX可能通过HMGB1介导的TLR4/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路对LPS诱导BEAS-2B细胞有较好的抗炎、抗氧化效应。3.右美托咪定对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的保护作用目的:本章旨在评估右美托咪定对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的保护效应并探究其机理。方法:NR8383被随机分为7组:正常对照组,LPS组,LPS+glycyrrhizin组,LPS+DEX(2μM)组,LPS+DEX(4μM)组,LPS+DEX(8μM)组和LPS+DEX(8μM)+glycyrrhizin组。细胞用DEX(2,4,and 8μM)进行预处理1小时,细胞与glycyrrhizin再孵育1小时后加入LPS(2μg/ml)。24小时后,收集细胞和上清液进行检测。Griess法检测NO含量;MTT法检测细胞活力;ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量;检测细胞中SOD和GSH-Px活性以及MDA含量;Western blot法检测细胞中HMGB1、TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达;免疫荧光分析细胞中HMGB1的表达情况。结果:DEX(2,4,and 8μM)能显著抑制NO生成;减少上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平;降低了MDA含量,增强了SOD和GSH-Px的活性。DEX能有效下调HMGB1、TLR4和MyD88的表达,抑制IκBα、NF-κB、PI3K、Akt和mTOR磷酸化;DEX联合HMGB1抑制剂甘草酸作用时下调和抑制作用更显著。结论:DEX可能通过HMGB1介导的TLR4/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路对LPS诱导NR8383细胞有较好的抗炎、抗氧化效应。本实验从体内体外较为系统的研究了右美托咪定(DEX)对LPS诱导大鼠急性肺损伤、LPS诱导人肺上皮细胞BEAS-2B、LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞NR8383等三个模型的药理作用。机制研究结果提示右美托咪定的抗炎抗氧化效应可能与HMGB1调控的TLR4/NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路有关。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R614
【图文】：

化学结构式,急性肺损伤,新药开发,作用研究

前言应, 并通过右美托咪定对体外不同种属来源细胞的作用研究, 进一步探其对急性肺损伤保护作用的抗炎抗氧化分子机制。以期为深入了解右的作用机理及后续新药开发提供实验参考。

嗜中性粒细胞,肺组织,比例,活力

图 2.1 右美托咪定对LPS诱导肺组织W/D 比例及BALF中嗜中性粒细胞、总细胞数量的影响。与正常对照组相比,##p<0.01,###p<0.001;与 LPS 组相比, *p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001。Fig 2.1 The effect of DEX on pulmonary W/D ratio, the number of neutrophilsand total cells in BALF.##p<0.01,###p<0.001 vs control group; *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001 vs LPS group.2.3.2 右美托咪定对 LPS 诱导大鼠肺组织 MPO 活力的影响我们检测了肺组织中 MPO 活力来评估炎性细胞的浸润和迁移程度。结果如图 2.2 所示, 与正常对照组相比, LPS 组大鼠肺组织中的 MPO 活性明显增强(p＜0.001)。与 LPS 组相比, DXM 组和 DEX(50 μg/kg)组大鼠肺组织中的 MPO 活性显著下降(p＜0.05), 而DEX(50 μg/kg) + glycyrrhizin组具有更强的降低MPO水平的能力(p＜0.01)。

肺泡,肺泡壁,肺组织结构,保护效果

图 2.2 右美托咪定对 LPS 诱导大鼠肺组织 MPO 活力的影响。与正常对照组相比,###p<0.001;与 LPS 组相比, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。Fig 2.2 The effect of DEX on pulmonary MPO activity.###p<0.001 vs controlgroup; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs LPS group.2.3.3 右美托咪定对 LPS 诱导大鼠肺组织病理损伤的影响用 H&E 染色评价 DEX 对肺部病理损伤的保护效果。如图 2.3 所示, 正常对照组肺组织结构完整, 肺泡壁无充血, 肺泡腔清晰, 肺泡间隔内无水肿及炎性细胞的浸润。与正常对照组相比, LPS 组肺泡腔变小, 肺泡间隔增厚, 肺泡壁充血水肿, 且有大量炎性细胞浸润。与 LPS 组相比, DXM 组和 DEX(50 μg/kg)组大鼠肺组织结构趋于正常、炎性细胞浸润得以缓解, 而 DEX(50 μg/kg) + glycyrrhizin组保护作用优于 DXM 组或 DEX(50 μg/kg)组。

【参考文献】