骨关节炎早期软骨退变靶向探针的构建及光声成像的研究
发布时间：2020-08-22 00:28
【摘要】：第一部分:黑色素纳米光声分子探针的制备和表征背景:光声成像是一种新兴、无创伤的生物医学成像模式,拥有高分辨率和高对比度,目前已广泛应用于疾病的影像学实验研究。然而,在大多数疾病的病理生理过程中,缺少内源性体现病理变化的光声造影物质。我们设计由多聚赖氨酸修饰天然的黑色素纳米粒子合成的光声分子探针,表面富含丰富的正电荷,能够与软骨基质中的GAGs靶向结合,从而量化软骨退变过程中GAGs含量变化。实验第一部分目的即制备富含正电荷的新型纳米黑色素光声探针并对其进行表征及鉴定。方法:水溶性黑色素纳米颗粒的制备:取黑色素颗粒溶解于0.1N的NaOH水溶液中,超声条件下(输出功率=10W)震荡,得到明亮的黑色素水溶液。用0.1N的HC1水溶液将其pH值调制中性(PH=7),过滤器过滤,用去离子水反复冲洗去除产生的氯化钠,将获得的黑色素水溶剂冻干,得到超细黑色素纳米颗粒MNP。MNP与多聚赖氨酸PLL的连接:将多聚赖氨酸加入到已准备好的MNP水溶液中搅拌、混匀,过夜,MNP通过静电吸引力作用被PLL包裹;次日,蒸馏法洗涤三次,获得光声分子探针PLL-MNPs。探针的表征及鉴定:在PBS溶液中测试探针的水溶性;在四氢呋喃中测试探针的紫外吸收光谱;在PBS溶液中测试溶液稳定性；Zeta电位分析仪测定探针的电位;激光照射检测材料的光稳定性;应用光声成像系统测试探针光声特性,绘制光声光谱曲线。用MTT法评估PLL-MNPs的细胞毒性。结果:成功合成了 PLL-MNPs纳米光声探针。纳米颗粒呈棕黑色,水溶性良好,溶解度可达到5 mg/ml,水合粒径稳定42.5 ±1.6 nm,并可在水溶液中长期保存,无聚集和沉淀。PLL-MNPs光声探针在水溶液中近红外吸收较宽,我们取680 nm作为本实验光声激发波长。Zeta电位分析仪测定MNPs的Zeta电位为-22.2 ± 12.1 mv,而我们合成的PLL-MNPs的电位为+32.5 ± 9.3 mV。PLL-MNPs探针溶液暴露在680 nm波长的激光照射下(8 mJ/cm2),在各时间点紫外-可见光-近红外光学下吸收光谱图中,我们可以看到光声探针的吸收几乎没有减弱,说明PLL-MNPs光稳定性良好。细胞毒性实验显示经不同浓度PLL-MNPs孵育24及48小时细胞成活率均保持在90%以上。结论:我们成功制备了富含大量正电荷的光声分子探针PLL-MNPs,它水溶性良好,易修饰,具有良好的光学稳定性、生物相容性以及良好的光声特性等优点,是一种优异的光声成像材料。第二部分:PLL-MNPs光声探针的软骨体外靶向结合力、敏感性和特异性评价目的:通过软骨体外实验,探讨PLL-MNPs光声探针对软骨GAGs靶向结合能力及对软骨退变中GAGs含量变化监测的敏感性和特异性。方法:取大鼠新鲜膝关节软骨作为体外实验软骨样品,设置探针及对照组:PLL-MNPs组,MNPs组,Blocking组及PBS组。Blocking组中采用带有正电荷的PLL作为竞争阻断材料,PLL溶液孵育软骨3小时后加入PLL-MNPs光声探针进行孵育。在摄取实验中,软骨在96孔板透明板内孵育各组探针,在不同的孵育时间(0～72小时)获得孵育样品并用PBS洗净,置入凝胶中进行光声测试,计算平均光声信号值。滞留实验中,软骨组织块按上述步骤孵育各组探针,然后浸入到PBS溶液中,在不同浸泡时间点(0,1,2,4,12,24,48,72小时)取出软骨样本置入琼脂糖凝胶中,进行光声检测,记录光声信号强度值。软骨退变分析实验中,软骨样品用硫酸软骨素酶ABC溶液(0,0.1,0.3,和0.5 U/ml的50毫摩尔Tris,0.02%BSA和60毫摩尔醋酸钠缓冲液,pH 8)在37℃处理24小时,得到不同含量梯度GAGs的软骨块。经不同电荷光声探针(PLL-MNPs,MNPs)孵育24小时,进行光声检测,绘制光声信号值和GAGs含量的相关曲线。结果:摄取实验显示,富含正电荷的PLL-MNPs光声探针具有更强的软骨摄取能力。原始软骨自身光声信号值为200,经探针孵育后24小时,与MNPs组(1425 ±46)相比,PLL-MNPs展示了更强的光声信号强度(2580 ±83);应用阻断剂预处理后,软骨摄取PLL-MNPs的能力明显减弱,证明了阳离子光声探针对软骨中带负电的GAGs具有靶向结合能力。孵育后软骨的光声光谱分析结果与探针在溶液中的结果基本一致。滞留实验中,MNPs组24小时后光声信号强度下降明显,而PLL-MNPs组仍保持了超过50%的信号强度;同时PLL-MNPs与MNPs在24小时时间点上滞留比最高,为1.86。在软骨退变分析实验中,PLL-MNPs孵育的正常关节软骨光声强度明显大于经软骨酶处理后的软骨,并且光声信号强度与软骨中GAGs浓度呈正相关(R2=0.83,p0.001);而MNPs组显示的相关性没有统计学意义(R2 = 0.38,p0.01);同时,在光声图像中也可清晰区分正常软骨与退变软骨,表明了阳离子光声探针PLL-MNPs能够灵敏的检测软骨基质中GAGs含量的变化。结论:通过一系列软骨体外实验研究证实,PLL-MNPs具有很强的软骨摄取能力,同时也证实了与软骨基质中GAGs的特异靶向结合。更重要的是应用PLL-MNPs光声探针,能够对软骨基质中GAGs含量变化进行监测,从而为下一步在体内实现骨关节炎早期诊断的实验研究奠定了基础。第三部分:PLL-MNPs光声探针早期诊断骨关节炎软骨退变的体内实验研究目的:利用小鼠骨关节炎模型,在体内验证PLL-MNPs光声探针早期诊断骨关节炎关节软退变及其鉴别不同时期骨关节炎的有效性。方法:通过调整成像参数及摆放动物体位应用光声成像系统实现对膝关节的活体解剖成像;采用切断板胫韧带手术致内侧半月板不稳诱导的方法建立小鼠OA模型;首先取术后4周作为早期软骨退变模型,关节腔注射光声探针及各对照组探针,通过光声图像观察及光声信号强度量化分析验证PLL-MNPs在骨关节炎早期软骨退变诊断的有效性。对造模术后4周骨关节炎模型分别行X线、MRI及PAI成像,评价各种成像模态早期诊断的有效性;对造模术后4周及8周的动物模型进行PAI检查,评估PLL-MNPs鉴别不同时期骨关节炎软骨退变的有效性。每一阶段实验结束后对模型标本施行病理检查,验证软骨退变及GAGs含量的变化。膝关节腔局部注射PLL-MNPs光声探针,应用大体观察及HE染色病理学检查检测探针的体内毒性。结果:首次应用光声成像系统对小鼠膝关节实现较清晰的解剖成像。应用切断板胫韧带手术诱导方法成功得到早期骨关节炎模型;经关节腔注射PLL-MNPs后,正常关节注射3小时后出现光声探针的聚集,表现为信号明显增强,而关节炎侧关节信号增强不明显(1441 ±109 vs.2113 ±103,p0.01)。同时PLL-MNPs在正常关节的滞留时间明显长于关节炎侧关节。作为探针对照组,MNPs与PBS组在两类关节中信号强度无明显差异。对比分析传统X线及MRI检查,X线在早期骨关节炎中无明显异常表现;MRI可以观察到骨关节炎病变关节中关节积液,但未发现软骨出现形态学病变;而经PLL-MNPs增强的光声成像可以清晰的区分早期软骨退变关节与正常关节GAGs含量的不同,从而实现早期诊断。在不同时期骨关节炎的鉴别中,造模术后4周的关节光声信号强度明显强于术后8周的关节(1454 ± 127,1036 ± 55,p ＜ 0.01)。以上实验最终都获得了病理结果的验证。对探针体内毒性进行进一步检测发现,经关节腔局部注射3天后膝关节未发现明显破坏及其他病理改变。关节腔注射PLL-MNPs光声探针3天后对主要脏器进行病理学检查,检查结果提示各脏器未见明显损伤及炎症改变。结论:本部分实验结果证明PLL-MNPs光声探针在活体内能够高效、精准靶向关节软骨GAGs,通过检测GAGs含量变化实现了骨关节炎软骨退变的早期诊断,并能够对不同时期骨关节炎软骨退变进行鉴别,敏感性较高,实现了对骨关节炎病情进展的观察和预测。此外,PLL-MNPs生物相容性好且体内毒性低,具有很好的临床转化前景。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684.3
【图文】：
逑３．２逦ＰＬＬ－ＭＮＰｓ的物理特性逡逑如图３所示，所制备的ＰＬＬ－ＭＮＰｓ光声探针为棕黑色悬液，静置后无分层逡逑现象。室温条件下，密封后长时间放置能保持较好的分散性，无沉淀产生。逡逑ＡＳＫ．逡逑■逡逑屋逡逑图３制备好的ＰＬＬ－ＭＮＰｓ在ＰＢＳ}槌逡海ǎ校儒澹藉澹罚矗┲械耐计ｅ义希常冲危校蹋蹋停危校笥耄停危校竽擅琢Ｗ拥谋碚麇义贤干涞缇低枷裆希停危校竽擅卓帕３是蛐危笮【龋砻嫫交暾帕ｅ义戏稚ⅲ蘧奂椭氐０邢蛐阅擅卓帕＃校蹋蹋停危校笮翁峁褂耄停危校竽擅卓佩义狭；疽恢拢ㄍ迹矗幔笮【龋砻嫫交暾帕７稚⑿粤己茫蘧奂椭劐义系唬模蹋咏峁允荆停危校竽擅琢Ｗ恿＞段担稿
本文编号：2800035
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684.3
【图文】：
逑３．２逦ＰＬＬ－ＭＮＰｓ的物理特性逡逑如图３所示，所制备的ＰＬＬ－ＭＮＰｓ光声探针为棕黑色悬液，静置后无分层逡逑现象。室温条件下，密封后长时间放置能保持较好的分散性，无沉淀产生。逡逑ＡＳＫ．逡逑■逡逑屋逡逑图３制备好的ＰＬＬ－ＭＮＰｓ在ＰＢＳ}槌逡海ǎ校儒澹藉澹罚矗┲械耐计ｅ义希常冲危校蹋蹋停危校笥耄停危校竽擅琢Ｗ拥谋碚麇义贤干涞缇低枷裆希停危校竽擅卓帕３是蛐危笮【龋砻嫫交暾帕ｅ义戏稚ⅲ蘧奂椭氐０邢蛐阅擅卓帕＃校蹋蹋停危校笮翁峁褂耄停危校竽擅卓佩义狭；疽恢拢ㄍ迹矗幔笮【龋砻嫫交暾帕７稚⑿粤己茫蘧奂椭劐义系唬模蹋咏峁允荆停危校竽擅琢Ｗ恿＞段担稿
本文编号：2800035
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