鲑鱼降钙素对大鼠腰椎关节突关节退变的作用及作用机制的研究

发布时间：2020-08-23 07:32

【摘要】：第一部分关节腔内注射二型胶原酶诱导大鼠腰椎关节突关节退变的实验研究目的:本研究拟使用二型胶原酶诱导大鼠腰椎关节突关节骨性关节炎(Facet Joint Osteoarthritis,FJ OA),为药物干预FJ OA建立动物模型。并通过组织学和micro-CT的方法检测该模型FJ软骨和软骨下骨的改变。方法:将20只三月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为Sham组和CI组(每组10只),分别行假手术和腰椎FJ关节腔内二型胶原酶注射手术。所有大鼠术后8周进行安乐死,使用甲苯胺蓝染色观察FJ软骨的组织学改变并进行评分。使用HE染色观察软骨下骨的组织学改变。使用micro-CT对软骨下骨的微结构参数进行分析。结果:甲苯胺蓝染色观察显示,Sham组大鼠FJ软骨表面光滑、规则,无裂缝及磨损;软骨细胞形态正常,无数量减少;软骨细胞外基质染色均匀,无染色丢失。CI组大鼠关节软骨出现了明显的退变。关节表面出现裂缝,部分裂缝深达中层软骨。局部软骨细胞数量出现了明显的减少。CI组大鼠关节软骨的组织学评分显著高于Sham组大鼠(P0.001)。HE染色观察显示,Sham组软骨下骨结构正常,骨小梁排列有序。CI组软骨下骨出现病变,局部出现明显的纤维样组织增生(囊肿)。Micro-CT分析结果显示,Sham组大鼠的右上关节突形态正常,呈细长形。而CI组大鼠的右上关节突形态发生了明显的改变,呈肥大状;与Sham组相比,CI组的BMD、BV/TV和Tb.Th显著降低(均为P0.001),但Tb.Sp和SMI显著增加(P=0.003和P0.001)。两组间的Tb.N值无显著统计学差异(P=0.177)。第二部分鲑鱼降钙素对二型胶原酶诱导的大鼠腰椎关节突关节软骨退变的作用研究目的:本研究拟对二型胶原酶诱导的腰椎FJ OA大鼠模型进行鲑鱼降钙素(Salmon Calcitonin,sCT)和塞来昔布(celecoxib,CLX)干预,研究两种药物对大鼠FJ OA关节软骨的作用。方法:将40只三月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为Sham组、CI组、CLX组和sCT组(每组各10只),Sham组大鼠行假手术;CI组、CLX组和s CT组大鼠行腰椎FJ关节腔内二型胶原酶注射手术。术后CI组大鼠进行皮下注射生理盐水治疗。CLX组大鼠经灌胃给予CLX治疗,剂量为50 mg/kg,每天一次。sCT组给予皮下注射sCT治疗,剂量为16 IU/kg,两天一次。治疗8周后对所有大鼠进行安乐死。使用甲苯胺蓝染色检测FJ软骨退变情况并进行组织学评分。使用免疫组织化学染色对FJ软骨中caspase-3、ADAMTS-4、Col-II、MMP-13和AGG的表达情况进行分析。使用酶联免疫吸附测定试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)对血清中COMP和MMP-13浓度进行分析。使用相关分析的方法对血清COMP浓度与改良Mankin评分之间的相关性进行分析。结果:甲苯胺蓝染色显示,Sham组大鼠FJ软骨表面光滑、规则。软骨细胞形态正常,软骨细胞外基质染色均匀。CI组大鼠关节软骨出现了明显的退变。关节表面出现裂缝,部分裂缝深达中层软骨,局部软骨细胞数量明显减少,软骨细胞外基质染色不均匀。经CLX治疗后,CLX组大鼠软骨退变情况得到了一定程度的缓解,但仍有较为明显的软骨表面损伤及局部染色丢失。sCT组大鼠软骨表面的裂缝明显减少,软骨细胞数量正常,细胞外基质染色较为均匀,软骨退变得到了显著的缓解。CI组大鼠的组织学评分显著高于Sham组大鼠(P0.001),sCT组大鼠组织学评分显著低于CI组(P=0.034)。免疫组织化学染色结果显示:CI组caspase-3的表达水平显著高于Sham组(P0.001),sCT组和CLX组caspase-3的表达水平均显著低于CI组(P0.001和P=0.010)。此外,s CT组caspase-3的表达水平显著低于CLX组(P0.001)。CI组AGG的表达水平显著低于Sham组(P0.001)。sCT组AGG的表达水平显著高于CI组和CLX组(P0.001和P=0.021),CLX组与CI组的AGG表达水平无统计学差异(P=0.097)。CI组ADAMTS-4的表达水平显著高于Sham组(P0.001)。sCT组ADAMTS-4的表达水平显著低于CI组和CLX组(P0.001和P=0.001)。CLX组与CI组的ADAMTS-4表达水平无统计学差异(P=0.103)。各组Col-II和MMP-13的表达水平均无统计学差异(P=0.489和P=0.753)。ELISA结果显示CI组血清COMP的浓度显著高于Sham组和sCT组(P=0.010和P=0.031),但CLX组COMP的浓度与CI组之间无统计学差异(P=0.282)。各组血清MMP-13的浓度无统计学差异(P=0.055)。血清COMP浓度与改良Mankin评分之间具有显著的正相关性(r=0.444,P=0.004)。第三部分鲑鱼降钙素对二型胶原酶诱导的大鼠腰椎关节突关节软骨下骨退变及相关疼痛的作用研究目的:本研究拟对二型胶原酶诱导的腰椎FJ OA大鼠模型进行s CT和CLX干预,研究两种药物对FJ OA大鼠软骨下骨退变及相关疼痛的作用。方法:将40只三月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为Sham组、CI组、CLX组和s CT组(每组各10只),Sham组大鼠行假手术;CI组、CLX组和sCT组大鼠行腰椎FJ关节腔内二型胶原酶注射手术。术后CI组大鼠进行皮下注射生理盐水治疗。CLX组大鼠经灌胃给予CLX治疗,剂量为50 mg/kg,每天一次。sCT组给予进行皮下注射sCT治疗,剂量为16 IU/kg,两天一次。治疗8周后对所有大鼠进行安乐死。在术前(第0天)和手术后第3、7、14、28、42和56天使用von Frey纤维丝对大鼠进行疼痛测试。所有动物安乐死后使用micro-CT对软骨下骨的微结构参数进行分析,并根据L4-L5FJ的micro-CT图片对FJ关节间隙、上关节突的长度(L)、高度(H)和L/H比值进行测量并进行micro-CT评分。使用相关分析的方法对micro-CT评分与改良Mankin评分之间,以及血清COMP浓度与micro-CT评分之间的相关性进行分析。结果:在整个实验过程中,Sham组大鼠未出现触觉异常性疼痛。术前(0天)其他三组大鼠也未出现触觉异常性疼痛。术后3天,该三组大鼠出现严重的触觉异常性疼痛;CLX组的50%PWT显著高于CI组(P0.001),但与sCT组相比无统计差异(P=0.146);sCT组与CI组之间也无统计差异(P=0.122)。在术后第7天,CLX组和s CT组的50%PWT均显著高于CI组(P=0.004和P=0.041);但sCT组与CLX组之间无统计学差异(P=1.000)。在术后第14天,CLX组和sCT组的50%PWT显著高于CI组(P=0.021和P=0.002);但s CT组与CLX组之间无统计学差异(P=1.000)。在术后第28天,sCT组的50%PWT显著高于CI组(P=0.002);CLX组与CI组及sCT组相比均无统计学差异(P=0.295和P=0.213)。在术后第42天和第56天,sCT组的50%PWT均显著高于CI组和CLX组(P=0.043和P=0.025;P0.001和P=0.020);但CLX组与CI组对比无统计学差异(P=1.000和P=0.625)。与Sham组相比,CI组的BMD、BV/TV和Tb.Th值显著降低(均为P0.001),但Tb.Sp和SMI显著增加(P=0.002和P=0.013)。与CI组相比,sCT组的BMD、BV/TV和Tb.Th值显著增高(P=0.003、P=0.001和P=0.040),而Tb.Sp和SMI值显著降低(P=0.019和P=0.031)。此外,与CLX组相比,s CT组的BMD和BV/TV值显著增高(P=0.016和P=0.004),而Tb.Th、Tb.Sp和SMI值无统计学差异(P=0.175,P=0.074和P=0.054)。CI组与CLX组的BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和SMI值均无统计学差异(P=0.541,P=0.515、P=0.459、P=0.545和P=0.803)。各组间的Tb.N值无显著统计学差异(P=0.096)。Sham组右上关节突的长度明显大于其高度,呈细长形。而CI组的右上关节突呈肥大状,高度显著增加。与Sham组相比,CI组关节突的长度下降了13.81%,L/H比值减少58.87%,但高度增加113.38%(均为P0.001)。与CI组和CLX组相比,s CT组的L/H比值分别增加60.42%和23.63%(P0.001和P=0.005),但高度分别减少34.14%和15.07%(P=0.001和P=0.098)。与CI组相比,CLX组的L/H比值增加了29.76%,但高度减少了22.45%(P=0.006和P=0.023)。各组间关节间隙宽度无显著差异(P=0.376)。CI组的micro-CT评分显著高于Sham组和sCT组(P0.001和P=0.002)。但CLX组与sCT组之间,及CLX组与CI组之间均没有统计学差异(P=0.685和P=0.230)。Micro-CT评分与改良Mankin评分(r=0.807,P0.001)以及血清COMP浓度和micro-CT评分(r=0.370,P=0.019)之间均具有显著的正相关性。第四部分鲑鱼降钙素对去势大鼠腰椎关节突关节软骨退变的作用研究目的:本研究拟使用去势(Ovariectomy,OVX)大鼠模型探讨雌激素缺乏诱导FJ软骨退变的特点及机制,以及sCT对FJ软骨退变的干预效果。方法:将30只3月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为Sham组、OVX组和OVX+sCT组(每组各10只)。Sham组大鼠行假手术;OVX组和OVX+sCT组大鼠行去势手术。术后OVX组大鼠进行皮下注射生理盐水治疗。OVX+sCT组给予皮下注射sCT治疗,剂量为16IU/kg,两天一次。治疗12周后对所有大鼠进行安乐死。使用甲苯胺蓝染色检测FJ软骨退变情况并进行组织学评分及软骨厚度测量。使用免疫组织化学染色对FJ软骨中caspase-3、Col-II和MMP-13的表达情况进行分析。使用ELISA法对血清中COMP浓度进行分析。使用相关分析的方法对血清COMP浓度与改良Mankin评分,以及血清COMP浓度与软骨厚度之间的相关性进行分析。结果:OVX组大鼠血清COMP浓度显著高于Sham组(P0.001)。经sCT治疗后,OVX+sCT组大鼠的血清COMP浓度显著低于OVX组(P=0.028)。Sham组和OVX+sCT组的血清COMP浓度无显著差异(P0.05)。甲苯胺蓝染色观察显示,Sham组FJ的软骨表面完整、光滑,软骨细胞结构正常,细胞外基质甲苯胺蓝染色呈均匀分布。OVX组大鼠出现明显的软骨退变,表现为软骨表面不规则及出现小裂缝。经sCT治疗后,OVX+sCT大鼠的软骨损伤在一定程度上得到缓解。OVX组大鼠关节的改良Mankin评分显著高于Sham组(P=0.015)。OVX组与OVX+sCT组之间,以及Sham组与OVX+sCT组之间的改良Mankin评分没有显著差异(均P0.05)。OVX组大鼠的软骨厚度与Sham组相比显著降低(P0.001)。OVX+sCT组的软骨厚度显著高于OVX组(P=0.024),但显著低于Sham组(P=0.007)。与Sham组相比,OVX组大鼠关节软骨MMP-13和caspase-3表达水平显著增高(均为P0.001)。与OVX组相比,OVX+sCT组大鼠关节软骨MMP-13和caspase-3表达水平显著降低(均为P0.001)。与Sham组相比,OVX+sCT组的MMP-13和caspase-3的表达水平无显著差异(均为P0.05)。各组间Col-II的表达水平没有统计学差异(P0.05)。血清COMP浓度与改良Mankin评分呈显著正相关(r=0.467,P0.05),但与软骨厚度呈显著负相关(r=-0.485,P0.05)。结论:1.FJ关节腔内注射二型胶原酶可导致SD大鼠关节突呈肥大性改变,关节软骨出现明显的损伤,软骨下骨出现纤维样组织增生(囊肿)及微结构退变。2.CLX与sCT对二型胶原酶诱导的SD大鼠FJ OA软骨均具有一定的保护作用,但sCT对软骨的保护作用更为显著。其作用机制可能与sCT维持软骨代谢平衡及抑制软骨细胞凋亡有关。此外,血清COMP可能具有预测FJ OA的潜力。3.FJ关节腔内注射二型胶原酶可导致SD大鼠出现显著的触觉异常性疼痛、关节突肥大、micro-CT评分增高以及软骨下骨退变。sCT与CLX均具有一定的镇痛作用,但sCT的长期镇痛效果更显著。此外,sCT还可以显著地降低micro-CT评分,并抑制软骨下骨退变及关节肥大。4.SD大鼠去势术后12周,雌激素缺乏可以导致FJ软骨出现明显的退变,尤其是软骨厚度显著下降。sCT干预可以抑制增强的软骨分解代谢活动以及血清中COMP水平的升高,对FJ软骨具有积极的保护作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684
【图文】：

软骨组织,甲苯胺蓝染色

30图 2 各组动物关节软骨组织学表现（甲苯胺蓝染色）Fig.2 Histological appearance of articular cartilage between groups(toluidine blue staining)Note: A: Sham group; B: CI group. "→" represents fissures of articularcartilage. Bar = 100μm.

动物体,甲苯胺蓝染色,软骨组织

各组动物体重变化

鲑鱼降钙素对大鼠腰椎关节突关节退变的作用及作用机制的研究

改良Mankin组织学评分结果

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