骨髓基质干细胞促内皮细胞迁移和成血管作用及系统性生物力学评价骨缺损的力学功能再生的研究

发布时间：2020-08-23 21:37

【摘要】：组织工程学的出现为组织损伤或机体创伤提供了一种组织再生的技术手段,将改变外科传统的“以创伤修复创伤”的治疗模式,从而使临床对损伤的治疗迈入无创修复的新阶段。对于组织工程组织的构建,目前最为重要的细胞是骨髓基质干细胞(BMSCs)和内皮细胞(EC)。BMSCs作为最广泛使用的种子细胞提供了组织构建的始动因素,体外培养带有细胞活性的生物材料并移植入体内,使得修复复杂创伤成为可能,同时内皮细胞作为组织工程血管化的承担者和执行者,如何快速激活静止的内皮细胞,及早完成植入体内组织的血管化阶段,对组织工程来说具有十分重要的意义。研究发现BMSCs发挥修复损伤的器官和组织的治疗作用是通过多靶点和多重作用机制。BMSCs能够分泌多种旁分泌因子,包括细胞因子、趋化因子以及营养因子等作用于不同细胞,发挥不同的调节作用。BMSCs复合材料移植入体内后,引起血管的长入,从而加速创伤的修复进程。然而目前尚缺乏其机制方面的研究。BMSCs能否能够通过旁分泌作用分泌某些因子作用于EC,以及通过什么样的途径调节EC进而促进其血管生成能力增加。这方面的探索对组织工程血管化有重要的价值。本研究第一部分利用BMSCs和RAOEC两种细胞,采用间接共培养体系模拟两种细胞的相互作用,并进一步探究BMSCs的旁分泌作用对EC产生的生物学影响,同时对共培养产生的细胞上清液中外泌体进行TMT蛋白定量检测,为后续的机制研究指明方向,结果显示BMSCs能够对RAOEC的增殖、凋亡、迁移、侵袭和成血管能力产生影响,并且外泌体生物信息学结果初步表明了BMSCs能够影响RAOEC与细胞外基质结合、粘附以及细胞内的信号通路的转导,筛选出的差异蛋白也为下一步的研究提供了基础。本课题组致力于骨组织工程的研究,通过构建骨缺损动物模型,在特定的观察时间段内,观察骨缺损的修复效果。在基础研究中多数实验研究对骨缺损的修复效果评估仍停留在组织学评估阶段,如HE染色、免疫组化和影像学等,反映的是骨损伤后修复过程中无机盐及胶原成分的累积程度。骨骼具有重要的生理功能,如运动、负重和保护内脏等,均与骨的力学性质密切相关,尤其对于长段骨来说。因此骨的质量和性能的恢复程度必须以骨的生物力学功能的恢复为标准。在基础研究中,EGFP转基因大鼠常被用作动物模型的构建、种子细胞的提取和报告基因的示踪等,然而作为一种动物模型,其骨缺损修复的能力尚未见报道。本研究第二部分通过制备野生型SD大鼠和转基因EGFP大鼠的股骨钻孔模型,利用系统性生物力学评价手段,对两组大鼠在不同恢复阶段的骨缺损修复效果进行比较,发现组织结构再生与功能再生评价分别在不同层面方面反应骨损伤修复的效果,真实反映出大鼠股骨孔性缺损在修复过程中组织再生和力学再生的特点,并且观察到生物力学功能评价能够较组织结构评价更敏感的发现两组对照组之间差异,丰富了对骨损伤修复评价的基础研究。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R68
【图文】：

信号传递,靶细胞,细胞外,分图

[28]。体内不同组织的不同细胞具有分图1 图中显示外泌体的形成是由内泌体融合形成MVB，成熟之后与细胞膜融合，将外泌体释放到细胞外，从而作用与靶细胞产生信号传递的作用

共培养,体系

我们采用了 BMSCs 和 RAOEC两种细胞形成的间接共培养体系（图2），上层 A 接种 BMSCs，下层 B 接种RAOEC 。图示的半透膜的孔径为0.4μm，细胞不能透过此半透膜，粒径在 0.4μm 以下的蛋白质等小分子物质可以自由穿过，在膜的上下两层中氧气、CO2和营养物质等可以自由交换。1) 细胞准备：浓度为 2×103/ml 的 P3 代 BMSCs，浓度为 1.5×103/ml 的 P5 代 RAOEC2) 实验分组：分为两组，分别为共培养实验组（Co-culture group）和单独培养对照组（Control group）。其中共培养实验组的小室内接种 BMSCs，六孔板内接种RAOEC

示意图,胶塞,基质,裸鼠

基质胶管腔形成实验：a) 将购得的基质胶（Matrigel）放在冰水浴中过夜融化；b) 实验所用的枪头、EP 管、96 孔板在实验前半小时置于-20℃预冷c) 取融化的基质胶（Matrigel）加入到 96 孔板，在设计好的孔里每孔加量不要有气泡，注意此步骤在冰上操作；d) 培养箱放置 30min，使基质胶（Matrigel）凝固；e) 收集两组经过 7 天培养后的 RAOEC，重悬并进行定量，细胞2.5×105/ml；f) 取上述定量后的细胞，每孔加 100μl 细胞悬液；g) 放置于培养箱中孵育 6h，在倒置显微镜下观察并记录拍照。注意：避免细胞浓度过大或过小，使成血管效果不明显；注意基质胶的特种细胞前，所有步骤都在冰上进行。) 体内基质胶塞实验（In vivo Materigel Plug Angiogenesis Assay）：

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