MECM基水凝胶复合3D打印支架构建组织工程半月板的实验研究

发布时间：2020-08-23 10:25

【摘要】：实验目的:①探讨MECM基水凝胶促进半月板纤维软骨细胞(Meniscus FibrochondrocytesMFCs)增殖和维持MFCs表型的能力;②MECM基水凝胶复合3D打印支架构建组3D打印半月板复合支架,并评价该复合支架的生物相容性及生物力学强度;③研究该支架修复兔膝关节半月板缺损的效果。实验方法:①以脱细胞半月板细胞外基质(decellularized meniscus extracellular matrix DMECM)和海藻酸钠为原料,制备5种不同浓度(0%,0.5%,1%,2%,4%)的MECM基水凝胶;②MECM基水凝胶复合P3代MFCs体外培养1、4、7、14d,通过死活染色、CCK-8细胞增殖实验、DNA定量、胶原定量、糖胺多糖(glycosaminoglycan GAG)定量和RT-PCR实验评估MECM基水凝胶促进MFCs增殖和维持MFCs表型的能力;③以聚己内醋(Poly(epsilon-caprolactone)PCL)为原料,结合3D打印技术构建仿生天然半月板胶原纤维排列的取向性支架,经过碱蚀刻材料表面处理后复合MECM基水凝胶构建3D打印半月板复合支架;通过CCK-8细胞毒性试验、大鼠皮下免疫排斥反应实验(1周,1月)、生物力学测试评价支架的生物相容性及生物力学性能;④选取4-6月龄骨骼成熟的健康新西兰大白兔,构建左膝关节内侧半月板缺损动物模型,随机均分为5组:假手术组(A组),复合支架/细胞组(B组),复合支架(C组),单纯支架组(D组)及空白对照组(E组),每组每个时间点8只,于术后3月、6月两个时间点取材,分别对修复组织行大体观察、组织学、分子生物学、生物力学分析和影像学评估。实验结果:①1、4、7、14d胶原定量、GAG定量和RT-PCR结果证实MECM基水凝胶均能很好的维持细胞表型,其中2%浓度组效果最好;DNA定量和CCK-8增殖实验证实MECM基水凝胶均能促进MFCs的增殖,其中2%浓度组作用效果最强;②CCK-8细胞毒性试验、大鼠皮下免疫排斥反应实验证实3D打印复合支架具有良好的生物相容性;③生物力学检测实验结果证实3D打印复合支架力学性能优于单纯PCL支架,接近于天然半月板;④术后3月、6月取材,大体观:A组半月板组织正常,无破坏,B、C、D三组均可见新月形新生半月板样组织形成,B组明显优于C和D组,E组仅有少量滑膜增生,未见半月板样组织形成,B、C、D组6个月时间点再生半月板样组织均明显优于3个月时间点;A组胫骨平台及股骨髁软骨表面光滑无磨损,B、C、D组胫骨平台和股骨髁软骨有不同程度的磨损,B组只见轻微磨损,明显优于C和D组,E组胫骨平台和股骨髁软骨磨损严重,可见骨赘形成和骨关节炎(osteoarthritis OA)表现;⑤组织学染色结果显示:B组新生组织甲苯胺蓝,番红O和天狼猩红染色强阳性,接近于A组,明显优于C组及D组,A组关节软骨正常,B组关节软骨磨损较轻,明显优于C、D、E组;⑥生物力学检测结果显示:B组拉伸模量和压缩模量均优于C组和D组,接近于A组;⑦新生组织GAG和胶原定量结果显示,B组GAG和胶原含量均高于C组和D组,接近于A组。⑧膝关节影像学(X线和磁共振)显示:A组膝关节形态结构正常,B组可见新生半月板样组织形成,软骨无明显破坏,C组和D组同样可见半月板样组织,形态明显小于B组,软骨有不同程度破坏;E组无新生半月板组织形成,成O A样改变。实验结论:MECM基水凝胶复合3D打印支架构建的3D打印半月板复合支架能促进MFCs增殖,维持MFCs表型,具有很好的生物相容性和良好的生物力学性能,能有效地修复兔膝关节半月板缺损,促进半月板的再生。因此MECM基水凝胶复合3D打印支架构建的3D打印半月板复合支架在未来组织工程半月板修复中具有很好的应用前景。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R687.4;R318.08
【图文】：

一、ＭＥＣＭ脱细胞前后的比较逡逑Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８荧光染色结果显示ＤＭＥＣＭ未见明显ＤＮＡ核酸物质残留，同样逡逑ＨＥ染色也可以看出ＤＭＥＣＭ材料中未见细胞核成分，进一步的残余ＤＮＡ定量测定逡逑结果显示几乎全部的ＤＮＡ物质得到去除。逡逑甲苯胺蓝染色和番红０染色结果显示ＭＥＣＭ脱细胞前后染色无明显区别，提逡逑示脱细胞过程中ＧＡＧ成分得到很好的保留；进一步的ＧＡＧ定量测定结果显示逡逑ＤＭＥＣＭ保留大量的的ＧＡＧ成分。逡逑天狼猩红染色显示ＭＥＣＭ脱细胞前后染色无明显差异，提示脱细胞过程中胶逡逑原成分得到很好的保留，进一步胶原定量测定结果显示脱细胞前后，胶原成分无逡逑显著性统计学差异，提示脱细胞过程没有造成胶原有效成分的丢失。逡逑＂＂

邋ＱＭＫＭ逦ＤＭ５ＣＭ逡逑图１－２天然半月板组织和ＤＭＥＣＭ组织学和成分分析（＊表示两组支架的比较Ｐ＜０．０５，邋＊＊表示逡逑两组支架的比较Ｐ＜０．０１）逡逑１６逡逑

解放军医学院硕士学位论文逡逑ＣＣＫ－８细胞增殖实验结果（图１－６）显示，随着培养时间的推移，不同浓度的逡逑ＭＥＣＭ基水凝胶的ＯＤ４５Ｃ值均呈现不同程度的递增趋势，提示ＭＥＣＭ基水凝胶具逡逑有良好的细胞相容性，有利于细胞的增殖；其中第４、７和１４ｄ时，可见２％浓度组逡逑ＯＤ４５（）值明显高于其他组，有显著性统计学差异（Ｐ＜０．０５），表明２％ＭＥＣＭ基水逡逑凝胶较其他浓度的水凝胶能更好促进ＭＦＣｓ的增殖。逡逑ｆ２５＿逦ｊ逡逑ｇ邋３逦Ｊｊ逡逑兮逦＾邋０．５＾逦｜逦ｒ逡逑ｇ邋２，０－邋Ｓ邋１％逦Ｊ逦自逡逑Ｉ邋１－５－逦＾邋４％逦＊逦｜｜｜邋Ｉ逡逑ｊ：；＾邋ｉｉｉ邋ｉｌｌ邋１１１逡逑＜逦Ｄａｙ１邋Ｄａｙ４邋Ｄａｙ７邋Ｄａｙ１４逡逑Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ邋ｔｉｍ？逡逑图１－６邋ＣＣＫ－８细胞增殖实验结果（＊表示同一时间点与其他各组之间的比较Ｐ＜０．０５）逡逑ＤＮＡ含量测定结果显示（图１－７），不同浓度的ＭＥＣＭ基水凝胶随着培养时逡逑间的增加，ＤＮＡ含量均逐渐增加，提示ＭＦＣｓ在不同浓度的ＭＥＣＭ基水凝胶中均逡逑能不断增殖；其中２％浓度组在不同时间点ＤＮＡ含量均高于其他组，有显著性统逡逑计学差异（Ｐ＜邋０．０５）

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 郭维民;刘舒云;高钺;黄靖香;彭江;汪爱媛;王玉;卢世璧;郭全义;;脱细胞半月板细胞外基质对半月板细胞的影响[J];中国医药生物技术;2015年03期

本文编号：2801409