长链非编码RNA-ASBEL在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用和分子机制研究

发布时间：2020-08-28 08:36

　　骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是最常见的骨的恶性肿瘤,其最常见于儿童及20岁以下的青少年,同时易于转移和复发,是儿童及青少年癌症相关死亡的主要原因。OS的恶性程度非常高,预后差。OS给社会及家庭带来了严重的负担和影响,一直是生命科学研究的重点,尽管相关研究很多,但其发病机制至今仍未给出很好的解释,而长链非编码RNA-ASBEL(lnc RNA-ASBEL)是一种重要的调控基因,与多种肿瘤的发生、发展和转移有关,但与OS的相关性研究目前尚无报道。故本研究将以分子生物学技术来探lnc RNA-ASBEL在OS发生发展中的具体作用,以便更好地认识骨肉瘤的发生发展机制,并为其寻找有效的治疗靶点和新治疗策略提供理论依据,具有重要的现实意义。【目的】(1)阐明lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤中的表达水平,以及它对骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响。(2)阐明lnc RNA-ASBEL通过调控mi R-21影响骨肉瘤细胞生物学行为的分子机制。【方法】第一部分:阐明lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤中的表达水平,以及它对骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响(1)对骨肉瘤细胞株MG63、OS-732和人成骨细胞株h FOB1.19进行培养。对上述组织进行总RNA的提取,采用q RT-PCR对样本进行lnc RNA-ASBEL基因检测,检测结果采用单向方差分析进行统计学分析。(2)选择骨肉瘤细胞株MG63进行培养,采用Lipofectamine 3000转染试剂转染MG63细胞,设三个组:Control组(只加lipofectamine),sh NC组(lipofectamine+sh NC),sh-ASBEL组(lipofectamine+sh-ASBEL)。转染后培养1、2、3、4天后,用q RT-PCR方式检测三组MG63细胞株的lnc RNA-ASBEL表达情况。采用台盼蓝排斥试验检测三组MG63细胞的增殖情况。采用Tranwell细胞迁移侵袭实验技术来检测三组骨肉瘤细胞的迁移侵袭情况。第二部分:阐明lnc RNA-ASBEL调控骨肉瘤细胞生物学行为的分子机制(1)lnc RNA-ASBEL对mi R-21在骨肉瘤细胞中表达的影响1)对骨肉瘤细胞株MG63进行培养,采用Lipofectamine 3000转染试剂转染MG63细胞,设三个组:Control组(只加lipofectamine),sh NC组(lipofectamine+sh NC),sh-ASBEL组(lipofectamine+sh-ASBEL)。转染后培养1、2、3、4天后,用q RT-PCR方式检测三组MG63细胞株的mi R-21表达情况。2)采用Lipofectamine 3000转染试剂转染MG63细胞,设三个组:NC组(lipofectamine+NC),mi R-21 mimic组(lipofectamine+mi R-21 mimic)和mi R-21inhibitor组(lipofectamine+mi R-21 inhibitor)。转染后1、2、3、4天后,用q RT-PCR方式检测被mi R-21 mimic和mi R-21 inhibitor干扰的MG63细胞株的mi R-21的表达情况。3)采用Lipofectamine 3000转染试剂将NC、sh NC、sh-ASBEL、mi R-21mimic转染MG63细胞,设四个组:Control组,sh NC+NC组,sh-ASBEL+NC组,sh-ASBEL+mi R-21mimic组。将细胞培养1、2、3、4天,采用台盼蓝排斥试验检测三组MG63细胞的增殖情况。采用Tranwell细胞迁移侵袭实验技术来检测骨肉瘤细胞的迁移侵袭情况。(2)mi R-21与PP2A对骨肉瘤细胞生物学行为的影响1)采用Lipofectamine 3000转染试剂将mi R-21 mimic和mi R-21 inhibitor分别转染至骨肉瘤细胞株MG63进行培养。转染后1、2、3、4天后,用q RT-PCR方式和Western blotting检测被mi R-21 mimic和mi R-21 inhibitor干扰的MG63细胞株的PP2A的m RNA和蛋白的表达情况。2)采用Lipofectamine 3000转染试剂将mi R-21 mimic分别与PP2A野生型载体(PP2A-wt)和PP2A突变型载体(PP2A-mt)共同转染至骨肉瘤细胞株MG63,通过荧光素酶活性检测分析mi R-21是否与PP2A 3,UTR结合。3)采用Lipofectamine 3000转染试剂将NC、sh-NC、mi R-21 inhibitor、sh-PP2A转染MG63细胞,设四个组:Control组,sh-NC+NC组,mi R-21 inhibitor+sh-NC组,mi R-21 inhibitor+sh-PP2A组。转染后培养1、2、3、4天,用q RT-PCR方式和Western blotting检测PP2A的m RNA和蛋白的表达情况。采用台盼蓝排斥试验检测三组MG63细胞的增殖情况。采用Tranwell细胞迁移侵袭实验技术来检测三组骨肉瘤细胞的迁移侵袭情况。4)采用Lipofectamine 3000转染试剂将NC、mi R-21 mimic、mi R-21 inhibitor、sh-PP2A转染MG63细胞,设四个组:NC组,mi R-21 mimic组,mi R-21 inhibitor组,mi R-21 inhibitor+sh-PP2A组。用Western blotting检测PI3K/AKT/GSK3β和MEK/ERK信号通路中蛋白的表达情况。【结果】1、lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤中的表达水平,以及它对骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响(1)相对于人成骨细胞株h FOB1.19,lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤细胞株MG63、OS-732的表达明显增高。提示lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤发生中发挥重要的作用。(2)相对于Control组和sh NC组,转染Sh-ASBEL后,lnc RNA-ASBEL的表达明显下降,骨肉瘤细胞MG63的活性、转移和侵袭均明显下降。提示lnc RNA-ASBEL的表达抑制将降低骨肉瘤细胞MG63的活性、转移和侵袭。2、lnc RNA-ASBEL调控骨肉瘤细胞生物学行为的分子机制(1)lnc RNA-ASBEL对mi R-21在骨肉瘤细胞中表达的影响1)相对于Control组和sh NC组,转染Sh-ASBEL后,mi R-21的表达明显下降。提示mi R-21参与lnc RNA-ASBEL的骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭的调节作用。2)转染mi R-21 mimic后,mi R-21的表达明显增加,转染mi R-21 inhibitor后,mi R-21的表达明显下降。3)相对于转染Sh-ASBEL的骨肉瘤细胞株MG63,同时转染Sh-ASBEL和mi R-21 mimic明显增加骨肉瘤细胞MG63的活性。通过mi R-21的过表达,可反转转染sh-ASBEL后导致的骨肉瘤细胞MG63的转移和侵袭的下降。提示mi R-21参与lnc RNA-ASBEL的骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭的调节作用。(2)mi R-21与PP2A对骨肉瘤细胞生物学行为的影响1)转染mi R-21 mimic后,骨肉瘤细胞株MG63中的PP2A的m RNA和PP2A蛋白水平明显下降,而转染mi R-21 inhibitor后PP2A的m RNA和PP2A蛋白水平明显增加。提示PP2A可能是骨肉瘤细胞株MG63中mi R-21的靶点。2)荧光素酶活性检测分析显示,转染mi R-21 mimic与PP2A野生型载体(PP2A-mt)组荧光素酶活性高于转染mi R-21 mimic与PP2A突变型载体(PP2A-mt)组。这进一步支持PP2A是骨肉瘤细胞株MG63中mi R-21的靶点。3)转染mi R-21 inhibitor后,PP2A的m RNA和PP2A蛋白水平明显增高,而通过转染sh-PP2A后,PP2A的m RNA和PP2A蛋白水平降低。4)PP2A沉默将明显减轻mi R-21 inhibitor导致的骨肉瘤细胞活性、转移和侵袭性的下降。这提示mi R-21将通过降低PP2A的表达来促进骨肉瘤细胞的增值、转移和侵袭。5)转染mi R-21 mimic后,p-PI3K,p-AKT,p-GSK3β,p-MEK和p-ERK在骨肉瘤细胞MG63的表达明显增高,转染mi R-21 inhibitor后,效果相反。通过PP2A的表达抑制可减轻转染mi R-21 inhibitor后的上述蛋白的表达降低。这提示mi R-21通过抑制PP2A的表达来激活骨肉瘤细胞的PI3K/AKT/GSK3β和MEK/ERK信号通路。【结论】lnc RNA-ASBEL促进骨肉瘤的发生发展过程,与其细胞增殖、转移和侵袭密切相关。lnc RNA-ASBEL沉默后,mi R-21的表达抑制。PP2A是骨肉瘤细胞株MG63中mi R-21的靶点,mi R-21将通过降低PP2A的表达来促进骨肉瘤细胞的增值、转移和侵袭。因此,我们认为ASBEL-mi R-21-PP2A通路在骨肉瘤的发生发展中发挥重要的作用。【创新】首次发现lnc RNA-ASBEL在骨肉瘤细胞系中的表达,且呈现增高表达,并首次探讨lnc RNA-ASBEL促进骨肉瘤细胞的增殖、转移和侵袭的分子机制,为寻找有效的治疗靶点和骨肉瘤的治疗策略提供理论依据,具有重要的现实意义。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R738
【部分图文】：

数据,棉签,视野计,无血清培养液

37℃下放置 30 min，使 Matrigel 聚合成胶，准备 Transwell 培养板。3、在无血清培养液中饥饿诱导细胞 12h，用 PBS 漂洗 3 次。用无血清备浓度为 5×105／ml 的单细胞悬液。4、将 100 l(5×104)细胞悬液和 200ul 无血清培养基加入 Transwell 培养Transwell 培养板下室加入 500 趋化因子，培养 24 小时（37℃，5％C025、取出小室，将基质胶和聚碳酯膜上表面的细胞用湿棉签擦去。6、用 PBS 漂洗 5 分钟，DAPI 工作液室温染色 5～20 分钟，PBS 漂洗封片剂封片。7、显微镜下随机取 6 个视野计数，取平均数。实验结果.1 lncRNA-ASBEL 在骨肉瘤细胞株中呈高表达状态

转染,小室

miR-21 的表达明显增加(P<0.01) ，转染 miR-21下降(P<0.01)。提示两者对 miR-21 表达干扰效果为检测 lncRNA-ASBEL 调节 miR-21 对骨肉瘤、shNC、sh-ASBEL、miR-21mimic 转染 MG63、4 天，采用采用台盼蓝排斥试验检测细胞的增转染 Sh-ASBEL 的骨肉瘤细胞株 MG63，同mic 明显增加骨肉瘤细胞 MG63 的活性(P<0.05)。转染 Sh-ASBEL 后导致的骨肉瘤细胞 MG63 的为研究 lncRNA-ASBEL 对骨肉瘤细胞迁移和侵nswell 小室实验。在 Transwell 小室实验中我们发反转转染 Sh-ASBEL 后导致的骨肉瘤细胞 MG5）,如图 C,D。提示 miR-21 参与 lncRNA-ASBEL作用。

过表达,活性下降,转染,骨肉瘤

2B：miR-21 的过表达可反转转染 Sh-ASBEL 后导致的骨肉瘤MG63 的活性下降数据以 mean ± standard deviation (SD)表示，ASBEL: long tisense ncRNA in the abundant in neuroepithelium area (Ation gene 3 (BTG3) locus; miR-21: microRNA-21; NC: negative *P < 0.01.

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