聚多巴胺修饰钛金属表面载铜涂层的制备及抗菌性能与促进骨整合的实验研究

发布时间：2020-08-28 11:08

　　第一部分表面载铜的钛金属材料的制备与表征检测目的:利用多巴胺在弱碱性条件下自聚合形成的聚多巴胺涂层沉积于钛金属表面,将铜离子通过聚多巴胺的螯合作用沉积在纯钛(Titanium,Ti)金属材料表面,制备出表面载铜的钛金属复合材料,并对其进行检测与表征。方法:将纯钛片依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗后,将上述材料避光浸泡在2mg/m L的多巴胺溶液中(10m M Tris-HCL溶液,PH=8.5)24小时,在纯钛片表面制备出聚多巴胺涂层(Ti-PDA),随后将含有聚多巴胺涂层的纯钛片分别浸泡在0.02 mol/L、0.1 mol/L和0.5 mol/L的Cu Cl2溶液中1小时,制备出表面具有不同含量载铜涂层的钛金属复合材料(Ti-PDA-Cu 0.02、Ti-PDA-Cu 0.1、Ti-PDA-Cu 0.5)。涂层的形貌和化学元素构成分别采用扫描电镜和X射线光电子能谱仪予以分析,自动化接触角测量仪测定各组涂层表面的水接触角、对各组涂层的可湿性进行分析,并检测三组不同含量载铜涂层的铜离子释放。结果:扫描电镜观察显示聚多巴胺涂层和掺入的铜元素未显著改变涂层的表面形貌。X射线光电子能谱分析显示,三组不同含量载铜涂层中分别含有4.28 at%、6.01 at%和8.47 at%的铜元素。接触角测试显示经过聚多巴胺涂层处理后各组材料表面的亲水性明显改善。铜离子释放试验证实三组不同含量载铜涂层均能够向周围溶液中持续释放铜离子。结论:利用多巴胺的自聚合以及聚多巴胺的螯合作用,能够在钛金属表面制备出不同含量的载铜涂层。聚多巴胺涂层和掺入的铜元素并未显著改变涂层的表面形貌,但涂层的化学构成发生改变,涂层的亲水性显著改善,不同含量载铜涂层均能够向周围溶液中持续释放铜离子。第二部分表面载铜的钛金属材料的体外抗菌性能检测目的:研究表面具有不同含量载铜涂层的钛金属复合材料对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌的抗菌性能。方法:以Ti-PDA、Ti-PDA-Cu 0.02、Ti-PDA-Cu 0.1、Ti-PDA-Cu 0.5作为实验组,将纯Ti片作为对照组,以金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25923和大肠杆菌菌株ATCC 25922为实验菌株。分别将金黄色葡萄球菌菌株与大肠杆菌菌株接种于各组材料培养24小时,采用平板计数法进行活菌计数,观察各组材料的抑菌效果,实验重复三次计算其抑菌率并拍摄涂板照片。结果:平板计数法抑菌实验结果提示:培养24小时以后,Ti-PDA-Cu 0.5和Ti-PDA-Cu 0.1组对金黄色葡萄球菌的平均抗菌率分别为99.4%和91.9%,显著高于(p0.01)Ti-PDA-Cu 0.02及Ti-PDA组,其对金黄色葡萄球菌的平均抗菌率分别为41.5%和10.2%。对大肠杆菌的平均抗菌率也有相似的趋势,Ti-PDA,Ti-PDA-Cu 0.02、Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5对革兰氏阴性大肠杆菌的平均抗菌率分别为11.9%、46.2%、92.3%和98.3%。拍摄的涂板照片显示,随着铜含量的增加菌落数逐渐减少,在Ti、Ti-PDA和Ti-PDA-Cu 0.02组,可见大量的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落,而在Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5组形成的细菌菌落明显减少。结论:表面具有不同含量载铜涂层的钛金属复合材料对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌均具有明显的抑菌作用,随着铜含量的增加其抑菌作用显著增强。其中,Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5组具有优良的抑菌性能。第三部分表面载铜的钛金属材料的生物相容性检测目的:研究表面具有不同含量载铜涂层的钛金属复合材料对MC3T3-E1成骨细胞粘附与增殖的影响。方法:以同样的细胞量将MC3T3-E1成骨细胞种植在五组不同的材料表面,将Ti设为对照组,采用扫描电镜于第24小时观察成骨细胞在不同材料表面的铺展情况;采用细胞计数CCK-8法分别在1、3、5、7天检测粘附于各组涂层表面的细胞数目;于24小时终止培养,对各组材料表面粘附的MC3T3-E1成骨细胞进行细胞肌动蛋白张力纤维、细胞核双重荧光染色,观察各组涂层表面的细胞骨架分布形态。结果:扫描电镜观察结果表明,在培养24小时后,MC3T3-E1成骨细胞在不同材料表面表现出不同的形态。细胞在纯Ti片组表现为相对圆的形状,而细胞Ti-PDA、Ti-PDA-Cu 0.02、Ti-PDA-Cu 0.1、Ti-PDA-Cu 0.5组表现为更加平坦和不规则的形状。CCK-8检测结果表明:各组材料表面的细胞在不同检测时间点均可以良好的增值。第1、3、5天时,纯Ti片组的细胞增殖优于Ti-PDA、Ti-PDA-Cu 0.02、Ti-PDA-Cu 0.1、Ti-PDA-Cu 0.5组,而在培养到第7天时,五组材料表面的细胞数量没有显著性差异。荧光染色结果显示:MC3T3-E1成骨细胞可以很好地粘附于各组材料表面,细胞在纯Ti片组因细胞骨架分布未充分铺展而表现为相对圆的形态,而在Ti-PDA、Ti-PDA-Cu 0.02、Ti-PDA-Cu 0.1、Ti-PDA-Cu 0.5组细胞骨架充分铺展从而表现出明显的扁平和不规则的形态。结论:通过将表面具有不同含量载铜涂层的钛金属复合材料与MC3T3-E1成骨细胞共培养观察,研究结果显示不同含量载铜涂层的钛金属复合材料不仅具有良好的生物相容性,而且有助于MC3T3-E1成骨细胞的细胞粘附和铺展。第四部分表面载铜的钛金属材料体内抑菌性能和促进骨整合的动物实验研究目的:研究表面具有不同含量载铜涂层的钛金属复合材料的体内抑菌性能及促进骨假体整合的生物学作用。方法:通过建立一种内植物感染相关的骨髓炎动物模型来模拟假体周围感染。以Ti-PDA、Ti-PDA-Cu 0.02、Ti-PDA-Cu 0.1、Ti-PDA-Cu 0.5作为实验组,将Ti金属作为对照组。实验使用了40只雄性SD大鼠并随机分为五组,采用微型电钻在左侧胫骨近端髓腔开孔并接种20μL浓度为104 CFU/m L的金黄色葡萄球菌悬液,随后植入长度为1厘米,直径为1.2毫米的定制型钛棒。我们通过Micro-CT与组织学切片及免疫组化染色系统研究了各组材料在体内的抗菌作用和促进骨整合的生物学作用。结果:HE染色显示术后2周Ti、Ti-PDA和Ti-PDA-Cu 0.02组内植物周围的骨组织中可见大量的中性粒细胞、术后4周可见许多慢性炎性细胞浸润,而在Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5组未见明显感染迹象。Masson染色提示在术后2周,Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5组骨组织/内植物界面有纤维组织形成,术后4周时骨组织/内植物界面可见纤维组织减少并伴有编织骨形成。而Ti、Ti-PDA和Ti-PDA-Cu 0.02组的骨组织/内植物界面未见新骨形成。TRAP染色结果显示术后2周Ti、Ti-PDA和Ti-PDA-Cu 0.02组内植物周围的骨组织中可见典型的破骨细胞活性增高的骨吸收征象、术后4周时破骨细胞数减少。而在Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5组未见明显的骨吸收征象。免疫组化染色显示术后2周,在Ti、Ti-PDA和Ti-PDA-Cu 0.02组内植物周围的骨组织中可见大量的金黄色葡萄球菌、Ti-PDA-Cu0.1组可见微量的活菌、Ti-PDA-Cu 0.5组则未见明显的活菌存在征象。术后4周,Ti、Ti-PDA和Ti-PDA-Cu 0.02组均有明显细菌感染,而在Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5组未检测到活菌存在。此外,术后4周Micro-CT扫描后的3D重建图像和定量分析进一步验证了组织学观察的结果。3D重建图像和新骨形成的定量分析(BV/TV)均显示在Ti、Ti-PDA组的骨组织/内植物界面有微量的新骨形成,Ti-PDA-Cu 0.02组的新骨形成优于Ti和Ti-PDA组,Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5组骨组织/内植物界面的新骨形成最多。结论:假体周围感染的动物模型表明Ti-PDA-Cu 0.1和Ti-PDA-Cu 0.5组具有优良的抗菌性能和促进骨整合的作用,因此有助于预防假体周围感染的相关并发症。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08;R68
【部分图文】：

示意图,活性金属离子,组织工程,骨组织

1 . 不同活性金属离子对骨组织的生物学作用及其在组织工程领域应用的示意图[32]于以上研究成果，目前认为将铜（Cu）、银（Ag）等具有抑菌性能的金属元素掺入到医表面可有效预防内植物相关感染，近年来研究者们在应用活性金属离子对医用材料改行了深入的研究并取得了良好的结果。例如，Wang 等[49]通过等离子体浸没离子注入含有银纳米粒子的抗菌涂层，研究结果证实了银纳米粒子的抗菌作用取决于底物的导了电子转移在抗菌过程中的重要性。此外，银纳米颗粒与钛基体之间的电子转移可在

示意图,多巴胺,骨整合,钛金属

多巴胺的应用原理示意图[69]

流程图,钛金属,涂层材料,多巴胺

图 4 . 聚多巴胺修饰钛金属表面载铜涂层材料的制备流程图参考文献1.Galia CR, Diesel CV, Guimar es MR, et al. Total hip arthroplasty: a still evolving technique.Rev Ortop. 2017 Sep 14;52(5):521-527.2.Daigle ME, Weinstein AM, Katz JN, et al. The cost-effectiveness of total joint arthroplastsystematic review of published literature.Best Pract Res Clin Rheumatol. 2012 Oct;26(5):649-63.Kapadia BH, Berg RA, Daley JA, et al. Periprosthetic joint infection. Lancet. 2016 23;387(10016):386-394.4.Kurtz S, Ong K, Lau E, et al. Projections of primary and revision hip and knee arthroplastthe United States from 2005 to 2030. J Bone Joint Surg Am. 2007Apr;89(4):780-785.5.Mcgrory BJ, Etkin CD, Lewallen DG. Comparing contemporary revision burden among hip and joint replacement registries. Arthroplast Today. 2016 May 27;2(2):83-86.

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