创伤性脑损伤后TLR4信号通路调控神经再生修复的作用与机制研究

发布时间：2020-08-28 16:32

　　创伤性脑损伤(TBI)的致残、致死率居各类创伤之首。近年来,随着临床神经学科对TBI救治水平的提高,患者生存时间显著延长,但仍有很大一部分TBI患者终身遗留不同程度的神经功能残疾或认知功能障碍,给个人、家庭和社会造成了沉重的负担。因此,深入研究TBI后神经再生修复,寻求合理可行的干预策略,改善TBI的预后,是亟待解决的重要科学问题。NSCs作为修复脑损伤的核心效应细胞,具有分裂增殖、多方向分化、主动趋向移行等生物功能。海马区作为CNS内源性NSCs的“巢区”,存在自主修复脑损伤的机制。在TBI损伤发生后,“巢区”内的NSCs被激活,通过增殖、分化、迁移、整合等过程,启动再生修复,建立新突触结构,修复TBI造成的神经功能缺失。然而,在TBI后的脑内复杂病理环境中,NSCs的自主再生修复能力十分有限,不足以弥补TBI造成的脑组织结构破坏和神经功能损害。因此,研究TBI后病理环境中制约NSCs再生潜能的瓶颈因素,阐明这些制约因素的深层调控作用机制,从根本上提升NSCs的再生能力、促进受损的神经功能重建,是改善TBI预后与转归的重要途径。TBI后影响脑内NSCs修复能力的因素繁多,其中,炎性反应伴随TBI损伤与修复的全过程,炎性反应一方面加重神经细胞的损伤,引起更为严重的脑功能损害,另一方面激活NSCs分裂增殖、多向分化,启动再生与修复。因此,深入研究TBI后调控炎症反应的信号分子与相关机制,对提升TBI后NSCs再生修复潜能意义重大。TLR4作为TLRs家族中发现最早的模式识别受体之一,通过识别外源侵入的病理相关分子模式,以及脑损伤后细胞释放的内源性损伤相关分子模式,活化下游Myd88和TRIF介导的两路信号途径,调控炎症反应发生发展。关于CNS的TLR4功能,早年多集中在其与胶质细胞介导的“瀑布式”炎症反应关系,后来逐渐关注到TLR4在神经元损伤转归中的作用。新近研究提示:体外培养的NSCs膜表面也可能存在TLR4,且可能影响NSCs增殖、分化等生物特性。然而,有关TBI后炎性环境中TLR4与内源性NSCs功能的研究,目前尚未见报道。因此,本课题基于TBI后神经再生困难这一难题,以海马区NSCs为核心,以TLR4为切入点,深入研究TBI后TLR4信号途径对NSCs再生修复的调控作用与相关机制,不仅是从全新的角度认识脑损伤后中枢再生与修复,也将可能为NSCs临床转化研究提供新的理论基础。研究目的本研究分别从体内、体外层面,探讨TBI后神经再生环境中海马组织TLR4的时空分布特征与表达意义,研究TBI后TLR4表达变化对NSCs增殖分化的影响作用,阐明TBI后TLR4信号通路调控NSCs再生修复的具体机制。研究方法本研究在稳定的C57BL/6小鼠TBI模型建立和体外NSCs培养基础上,采用免疫荧光共标染色、蛋白印迹、RT-PCR等方法,检测TBI后海马区TLR4的细胞定位与表达水平,分析TLR4表达与NSCs增殖之间的潜在联系。在此基础上,采用TLR4基因缺失小鼠和TLR4药理学抑制/激动剂干预,通过体内、体外免疫荧光多重染色、CCK-8分析、蛋白印迹、透射电镜、激光共聚焦显微镜观察等方法,分析TBI后TLR4表达变化对NSCs增殖能力、分化转归的影响作用。进一步采用药理学抑制剂与siRNA技术,体内、体外调控TLR4下游Myd88与TRIF途径的关键分子,通过细胞荧光特异性标记染色、FCM、ELISA、蛋白印迹、Morris水迷宫认知功能检测等方法,分析海马SGZ的NSCs增殖能力与分化转归,阐明TLR4信号下游调控TBI后NSCs增殖与分化的具体机制。研究结果1.同假损伤组相比,TBI组海马区SGZ的BrdU/TLR4阳性NSCs数量显著增多,即:伤后第3天NSCs增殖数量开始增加,高峰期出现在伤后第7天,第14天、21天与28天NSCs的增殖数目逐渐减少,但仍高于假损伤组。TBI后海马区TLR4蛋白与核酸表达均显著增加,且时程上与NSCs的增殖趋势一致。2.体内实验中,同野生型小鼠组比,TLR4~(-/-)小鼠TBI后海马区SGZ的BrdU/SOX2共标阳性NSCs细胞数显著增多,由NSCs分化的BrdU/DCX、BrdU/NeuN共标阳性神经元数量增多,而由NSCs分化的BrdU/GFAP共标阳性胶质细胞数量下降。体外实验中,TLR4抑制剂TAK-242干预组NSCs成球率高于对照组,且Nestin、TUJ1标记阳性NSCs及其分化的神经元数量增多,GFAP、O4标记阳性胶质细胞数量减少。TLR4配体LPS干预组NSCs成球率较对照组下降,Nestin标记阳性NSCs数量减少,TUJ1标记阳性的神经元细胞数减少,而GFAP、O4标记阳性胶质细胞数量增多。3.体内实验中,同TBI组相比,Myd88抑制剂ST2825干预的TBI+ST组BrdU/SOX2、BrdU/NeuN共标阳性NSCs及其分化的神经元数量增加,TRIF抑制剂RES干预的TBI+RES组BrdU/SOX2共标阳性NSCs数量增加,但BrdU/NeuN共标神经元数量较TBI组无统计学差异;TBI+ST组小鼠寻找平台的潜伏期缩短,记忆象限穿越次数与轨迹增加,而TBI+RES组小鼠学习、记忆能力较TBI组无统计差异。体外实验中,同LPS组比,Myd88 siRNA+LPS干预组BrdU、TUJ1阳性的NSCs及其分化的神经元数量显著增加,GFAP阳性的胶质细胞数明显减少,NSCs培养液中抗炎与促炎因子的含量显著减少;TRAM siRNA+LPS干预组BrdU阳性的NSCs数量显著增加,TUJ1、GFAP标记阳性的细胞数无统计差异,NSCs培养液中抗炎因子含量减少,但促炎因子含量无统计差异。研究结论在体内证实了TLR4表达于小鼠海马区SGZ的NSCs表面。TBI后海马SGZ的NSCs主导的神经再生进程中,TLR4表达变化特征与NSCs增殖趋势在时程上一致。抑制TLR4可促进NSCs增殖更新和分化为神经元,有助于提高TBI后神经再生能力,其作用机制是由TLR4信号下游的Myd88与TRIF途径共同介导,但两条通路下游炎症因子呈差异性表达,导致其对NSCs的调控效应不同。TLR4-Myd88途径对NSCs增殖潜能与分化转归均有调节作用,TLR4-TRIF途径仅调控NSCs的增殖潜能,不参与调控其分化命运。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R651.15
【部分图文】：

课题,再生修复,军医大学,相关机制

空军军医大学博士学位论文尚未见到报道。因此，本课题基于 TBI 后神经再生困难这一为核心，以 TLR4 为切入点，深入阐明 TBI 后 TLR4 信号途径控作用与相关机制，从全新的角度认识脑损伤后再生与修复床转化研究提供新的理论基础（图 1）。利用多种体内、体外分子生物学方法与实验技术，在形态、 TBI 后炎性环境中海马区 TLR4 的时空表达变化特征与意义达变化对 NSCs 再生修复的影响作用与功能，阐明 TBI 后 TLR 再生修复的具体机制，将可能为改善 TBI 后神经再生修复带来

模式图,模式图,微环境,细胞外基质

由 NSCs 周围的支持细胞、细胞外基质和分泌因子等组成的三维空间结构（图1）。在空间上，龛性结构使 NSCs 与微环境细胞紧密接触联系，介导 NSC 与胶质细胞、NSCs 与血管内皮细胞之间的相互作用；在功能上，龛性结构使微环境因素调控 NSCs 的存活、增殖和分化等，细胞外基质中的神经营养因子、粘连蛋白及炎性因子复合作用于 NSCs，决定 TBI 的预后与转归[25]。图 1：神经再生微环境模式图因此，深入研究脑损伤后制约 NSCs 生物学行为的瓶颈因素，探讨合理、可行、有效的 NSCs 内在生长力和（或）外部微环境干预策略

炎症因子,脑损伤,受体,果蝇

图 2：炎症因子对 NSCs 修复脑损伤的双面调控作用图l 样受体炎性信号途径ll 样受体家族概论oll 样受体(Toll like receptors, TLRs)是细胞感应外部因素刺激后，识别损反应的第一道防线蛋白，是调控机体免疫应答的重要屏障分子，与感染所致炎症反应的关系密切。TLRs 基因自 1985 年在果蝇体内被发随后的研究不断揭示其越来越多的功能，由早期控制果蝇胚胎生长发育化的作用，到后来编码调控多肽清除病原微生物感染的免疫功能[41, 42]鲁大学免疫学家 Medzhitov R. 教授首次报道了与果蝇同源的 Toll 样受一 TLR4 表达于哺乳动物体内，并证实了 TLR4 参与调节适应性免疫应的功能[43]。目前为止，在人类已发现多达 11 种 TLRs 家族亚型受体，有 13 种 TLRs 家族亚型受体，TLRs 在进化上具有良好的保守性，哺乳

【参考文献】