JAM-A mRNA作为ceRNA调控PTEN抑制表皮细胞增殖的机制研究

发布时间：2020-09-08 09:47

　　在创面愈合过程中,表皮细胞发挥着关键作用,其功能状态深刻影响着创面愈合的质量。而这其中,表皮细胞的增殖活性是影响创面愈合的重要机制之一。在表皮细胞的增殖过程中,诸多分子及信号通路参与了其增殖活性调控过程,其中链接黏附分子A(Junctional Adhesion Molecule A,JAM-A)近年来逐渐成为研究热点。JAM-A是一种跨膜蛋白,属于细胞间粘附分子家族,结构中包含PDZ结构域,同源二聚化后能够与胞内含PDZ结构域的分子结合,发挥信号转导功能。同时,JAM-A本身是粘附分子,与细胞的粘附、迁移功能密切相关,高表达于表皮细胞、内皮细胞、炎症细胞、间充质干细胞等多种细胞的膜表面,参与了上皮细胞屏障形成、调节免疫稳态和炎症、血管新生等过程。据最新的研究显示,除了调控细胞粘附、迁移以及信号转导外,JAM-A还能够正向调控肿瘤细胞的增殖活性,在骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、睾丸癌、头颈部鳞癌等恶性肿瘤中,JAM-A的表达均显著提高,与癌细胞的增殖、侵袭、趋化等功能呈现出明显的正向相关关系。而我们前期通过预实验发现,干扰JAM-A表达后,表皮细胞增殖速度反而较高表达JAM-A的表皮细胞明显加快。显然,这与JAM-A在上述肿瘤组织中的功能是矛盾的,那JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控到底是正向还是负向?此外,在这些肿瘤研究中,JAM-A表现出来的功能多是由蛋白来发挥的,鲜有学者关注其长达3600bp、内有大量非编码RNA结合位点的3’UTR区域,那JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控是否依然是其蛋白分子发挥主要作用?由于microRNA主要通过与靶分子mRNA的3’UTR区结合发挥转录后抑制作用,所以我们猜想,JAM-A在正常表皮细胞中对增殖活性的调控是否也是通过microRNA来实现的?我们通过检索文献发现,miR-21、miR-31、miR-203、miR-205、miR-210等多种microRNA,参与了创面形成后表皮细胞增殖功能的调控。但目前尚无文献报道microRNA通过与JAM-A的3’UTR区结合调控细胞增殖。这提示我们,或许可以挖掘到与JAM-A 3’UTR区结合的新的miRNA。因此,根据以上JAM-A、microRNA与细胞增殖有关的研究进展,结合我们预实验结果,我们拟从非编码RNA角度切入,在表皮细胞中深入探索JAM-A是否通过microRNA机制发挥与其在肿瘤细胞中相反的调控作用。我们拟在确认预实验现象的基础上,进一步通过高通量测序筛选差异表达的非编码RNA,结合生物信息学分析筛选潜在的非编码RNA靶向识别结合的分子,探索JAM-A通过非编码RNA调控下游增殖关键调控分子,进而负向调控表皮细胞增殖功能的新机制。这将有助于更加深刻地理解创面愈合过程,为后续在糖尿病足、压力性溃疡等慢性难愈性创面中探索促愈合机制、寻找潜在的临床治疗靶向药物奠定基础。JAM-A影响表皮细胞增殖活性,过表达JAM-A抑制表皮细胞增殖,干扰JAM-A促进表皮细胞增殖据课题组前期研究显示,干扰JAM-A表达后表皮细胞增殖速度加快,这与文献报道的并不一致。为了明确JAM-A在表皮细胞中的对增殖活性的影响,我们用慢病毒作为载体,分别构建了过表达JAM-A、干扰JAM-A的人永生化表皮细胞HaCaT,通过CCK-8和ki67实验证明,过表达JAM-A后表皮细胞增殖减慢,干扰JAM-A后表皮细胞增殖加快,与我们预实验结果一致,与文献报道JAM-A在肿瘤细胞中正性调控增殖功能相矛盾。JAM-A通过其mRNA的3’UTR区结合miR-221/222 cluster调控表皮细胞增殖功能的作用既往文献报道,JAM-A在肿瘤细胞的迁移、增殖中发挥作用,往往通过蛋白质-蛋白质相互作用的方式。我们通过PubMed网站Gene数据库,发现JAM-A mRNA的3’UTR区有大量的microRNA结合位点,并从miRNA数据库中预测JAM-A3’UTR区能够结合多条microRNA。因此,我们拟从microRNA的角度切入,探索JAM-A调控表皮细胞增殖功能的可能分子机制。为验证科学假设,我们在干扰JAM-A表皮细胞的基础上,分别构建了过表达CDS区、过表达3’UTR区的表皮细胞,通过PCR证明JAM-A调节表皮细胞增殖活性是通过其3’UTR区。接下来,我们设计了Dicer酶敲除实验,进一步证明JAM-A是通过其3’UTR区与microRNA结合的方式来发挥调节表皮细胞增殖的功效。基于上述发现,我们将过表达JAM-A、干扰JAM-A的表皮细胞进行RNA-seq高通量测序,结合生物信息学分析和文献检索,依据(1)在过表达组表达量明显下调、(2)在干扰组明显上调、(3)在细胞内基础丰度2000TPM以上、(4)靶点与细胞增殖有关的microRNAs。经过初筛,miR-221和miR-222完美符合上述标准,不仅排名靠前,而且同属一簇。通过RT-PCR,我们验证了干扰JAM-A后miR-221/222表达上调,而过表达JAM-A 3’UTR区后miR-221/222表达下调。通过体外细胞实验,我们也证明了miR-221/222的拟似物促进表皮细胞增殖,抑制物抑制增殖。据此,miR-221/222 cluster确立为研究对象,JAM-A 3’UTR负向调控miR-221/222。miR-221/222 cluster同时靶向结合JAM-A、PTEN发挥转录后抑制作用目前研究显示,microRNA主要通过与靶基因mRNA的3’UTR区识别结合,导致靶基因mRNA降解或者干扰其正常表达,从而发挥转录后抑制作用。为进一步阐明miRC在表皮细胞中发挥抑制增殖功能的分子机制,我们拟寻找与其功能吻合、直接识别结合的下游靶分子。通过对miRC靶分子的预测分析(microRNA.org、targetscan、miRbase)以及检索PubMed和Web of Science等文献数据库,我们锁定了PTEN为miR-221/222潜在的下游靶分子,并通过双荧光素酶报告基因实验验证了我们的设想,此外双荧光素酶报告基因实验还进一步证明了miR-221/222能够同时靶向JAM-A和PTEN。接下来,通过细胞和分子实验,我们进一步验证了miR-221-3p、miR-222-5p的拟似物负向调控JAM-A和PTEN表达,抑制物正向调控JAM-A和PTEN表达,随后又通过rescue实验发现过表达miR-221-3p、miR-222-5p后能够降低过表达JAM-A 3’UTR后PTEN的表达水平,进一步证明了JAM-A mRNA保护PTEN免于被miR-221-3p/222-5p降解。JAM-A 3’UTR突变体对PTEN无调控作用,对表皮细胞增殖功能无抑制效果最后,我们探索了miR-221/222 cluster在JAM-A 3’UTR区具体的结合位点。由于miR-221在JAM-3’UTR区有3个结合位点,在PTEN有2个结合位点,故而重点选择miR-221-3p为主要研究对象。基于JAM-A 3’UTR区序列和miR-221-3p的3个结合位点,我们分别构建了各个位点突变体和全突变体质粒,根据双荧光素酶报告基因实验的结果,证明miR-221-3p与JAM-A 3’UTR区三个位点均可结合。因此,后续实验皆以全突变体为实验对象,分别通过RT-PCR和CCK-8实验验证了JAM-A3’UTR突变体对PTEN无调控作用,对表皮细胞增殖活性无抑制效果。综上所述,在本研究中,明确了JAM-A参与负向调控表皮细胞增殖活性,这种调控方式依赖于其mRNA的3’UTR区,而非传统的蛋白-蛋白间直接的相互作用,筛选得到了miR-221/222 cluster,并进一步筛选得到miR-221/222的下游靶分子PTEN。随后的机制研究中,我们明确了miR-221/222能够同时靶向结合JAM-A和PTEN,阐明了miR-221/222具体的结合位点,勾勒出JAM-A、miR-221/222 cluster、PTEN之间清晰的关系网络。本课题对于从microRNA角度理解表皮细胞增殖活性的调控机制进行了有益的探索,加深了对创面愈合过程中表皮细胞增殖功能的调控机制认知,有利于将来针对性开发促进创面愈合的新药。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R64
【部分图文】：

示意图,示意图

pMIR-REPORTLuciferase示意图

基因修饰,慢病毒感染,慢病毒,上皮细胞

-27-图 2 JAM-A 基因修饰的 HaCaT 细胞符合上皮细胞特点，同时表达 GFP通过慢病毒感染人永生化表皮细胞 HaCaT，分别得到携带绿色荧光蛋白 GFP 的 JAM-AOVHaCaT、JAM-AKD HaCaT、慢病毒空载体 vector HaCaT 和 scramble HaCaT。细胞继续培养 3 天后，生长融合至 90%，各组细胞置于荧光倒置显微镜观察。在白光视野下，四组细胞形态符合上皮细胞特点，在绿色荧光视野下，四组细胞均表达 GFP。四组细胞进一步通过对角质蛋白（KRT）进行免疫荧光染色后，四组细胞在基因修饰后依然正常表达角质蛋白，证明基因修饰并没有改变 HaCaT 上皮细胞的性质，并且慢病毒载体已经进入 HaCat 基因组，能够正常表达目的蛋白和GFP。

细胞增殖,实验证明,表皮细胞,对照组

-28-图 3 敲除 JAM-A 后表皮细胞增殖明显加快（A）CCK-8 实验证明 JAM-AKDHaCaT 细胞增殖最快，在第 3、5、7 天的检测结果中均高于对照组 HaCaT 和 JAM-AOVHaCaT。（B）通过检测 JAM-AKD、JAM-AOV及对照组细胞中ki67 的表达情况证明 JAM-AKDHaCaT 细胞增殖速度最快。****，P＜0.0001，***，P＜0.001，** P＜0.01（2 way ANOVA），n=3。

【参考文献】