无机多聚磷酸盐对人椎间盘细胞基质代谢的影响及作用机制研究
发布时间：2020-09-10 10:55
椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)被认为是骨科最常见的疾病之一,也是导致颈部或腰背部疼痛的主要原因,已成为主要的公共卫生问题,在世界范围内对社会经济造成重大影响。IDD的病因是复杂和多因素的,包括基因遗传、年龄、营养代谢、生物力学等。尽管引发该疾病的机制乃存在争议,但普遍认为IDD是由于椎间盘细胞合成代谢和分解代谢之间不平衡导致椎间盘细胞外基质减少所致。目前临床治疗方法包括保守治疗和手术治疗,仅能减轻症状,无法阻止IDD的发生和发展,目前缺乏理想的治疗方法能够逆转IDD病变。近来生物治疗IDD的技术逐渐得到发展,包括细胞治疗、组织工程、生长因子和/或生物活性化合物。无机多聚磷酸盐(inorganic polyphosphate,PolyP)作为一种生物活性化合物广泛存在自然界和所以生物体中,它是由几个至数百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体。研究认为PolyP的共价键中储存高能量,其释放出来的能量可参与氨基酸、核苷酸、糖和脂类这些主要分子的构建。在体外实验中已报道PolyP能够增加软骨细胞及软骨组织基质的合成。此外,研究发现在牛的椎间盘组织中检测到PolyP,0.5-1.0mM浓度的PolyP可以通过上调髓核细胞基质基因的表达从而提高髓核组织合成代谢。目前PolyP对人的椎间盘细胞基质和能量代谢的影响尚未见研究报道。因此,我们假设PolyP作为一种能量来源,能增加人椎间盘细胞外基质的合成从而有利于干预和逆转IDD。第1部分无机多聚磷酸盐对椎间盘细胞增殖和基质代谢的影响目的:研究PolyP对人椎间盘纤维环细胞增殖和基质代谢的影响。方法:体外分离培养人椎间盘纤维环细胞,用三种不同浓度0,0.5mM和1.OmM PolyP-22(22磷酸盐单位长度的PolyP)处理人的椎间盘纤维环细胞,在倒置的显微镜下观察PolyP处理后的纤维环细胞在不同时间点的细胞形态学变化,并采用CyQUANT细胞增殖试剂法检测细胞的增殖活性变化。利用不同浓度 PolyP 处理纤维环细胞 48 小时后,用 1,9-DimethylmethyleneBlue(DMMB)方法测定细胞糖胺聚糖含量、采用同位素35S-硫酸盐标记法检测细胞蛋白聚糖的合成量,采用同位素3H-脯氨酸标记法检测细胞胶原蛋白和总蛋白的合成量。结果:PolyP能够提高人椎间盘纤维环细胞的增殖活性;采用DMMB方法测定和同位素标记法检测的结果也表明PolyP能够增加细胞糖胺聚糖,蛋白聚糖,胶原蛋白和总蛋白的合成量。结论:PolyP能够促进纤维环细胞增殖,并能提高细胞基质的合成量。第2部分无机多聚磷酸盐对椎间盘细胞基质代谢的作用机制目的:探讨PolyP对椎间盘内细胞基质合成和分解代谢动态平衡的影响;以及探讨PolyP对椎间盘细胞ATP生成量的影响。方法:用三种不同浓度0,0.5mM和1.OmM的PolyP-22处理人的椎间盘纤维环细胞48小时后;用qRT-PCR检测合成代谢的活性介质聚集蛋白聚糖(aggrecan)和I型胶原(collagenI)的mRNA的表达,以及检测分解代谢的活性介质基质金属蛋白酶-1(matrix metalloprotease-1,MMP-1)、MMP-3、血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS-4)和 ADAMTS-5 的 mRNA 的表达;采用蛋白免疫印迹(Western Blot)和免疫荧光细胞化学检测法在蛋白水平检测合成代谢的标志物aggrecan和collagen I的表达,并采用Western Blot检测分解代谢标志物aggrecan-fragment的蛋白表达;最后,利用ATPlite荧光免疫法测定三种不同浓度PolyP处理椎间盘细胞后在不同时间点的ATP生成量的变化。结果:qRT-PCR结果分析说明PolyP处理的人椎间盘纤维环细胞中,细胞代谢合成的aggrecan和collagen I的mRNA表达得到上调,但是在代表分解代谢的基因表达中,PolyP上调MMP-3和ADAMTS-4的mRNA表达而降低MMP-1和ADAMTS-5的mRNA表达。免疫荧光和Western Blot的结果同样证明PolyP能够增加椎间盘治疗纤维环细胞中aggrecan和collagen I的蛋白表达。但是Western Blot的结果表明分解代谢aggrecan-fragment的蛋白表达升高。同时PolyP能够增加人椎间盘纤维环细胞的ATP的生成量。结论:在椎间盘纤维环细胞中,增加PolyP含量可以上调细胞基质合成基因的表达和ATP生成量,促进纤维环细胞的合成代谢,但要确定PolyP如何在椎间盘细胞中调节分解基质代谢和整体代谢平衡还需要更多的验证性研究。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R681.5
【部分图文】：
贴壁较对照组快；所有组细胞形态均正常，未见细胞形态不规则，胞核固缩。与逡逑对照组比较，０．５ｍＭ和ｌ．ＯｍＭ邋ＰｏｌｙＰ两组椎间盘纤维环细胞生长较快，胞质丰富，逡逑伪足伸出明显，但两处理组之间未见明显区别（图１）。逡逑３ｈｏｕｒｓ逡逑２４ｈｏｕｒｓ逡逑＞邋？邋？逡逑４８ｈｏｕｒｓ逡逑ｍ’逦：逦ｊ邋ｍ逡逑ＯｍＭ邋ＰｏｌｙＰ逦０．５ｍＭ邋ＰｏｌｙＰ逦ＩｍＭ邋ＰｏｌｙＰ逡逑图１．用不同浓度ＰｏｌｙＰ处理纤维环细胞后，倒置相差显微镜下观察不同时间点三组纤逡逑维环细胞形态学变化情况。逡逑Ｆｉｇｌ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｗｉｔｈ邋ＰｏｌｙＰ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｗｅｒｅ逡逑ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｕｎｄｅｒ邋ａ邋ｐｈａｓｅ邋ｃｏｎｔｒａｓｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ．逡逑１．４．２无机多聚磷酸盐对人纤维环细胞增殖活性的影响逡逑为了评估ＰｏｌｙＰ对人纤维环细胞增值的影响，并确定ＰｏｌｙＰ浓度与细胞增殖逡逑的关系，本实验中使用不同浓度ＰｏｌｙＰ处理人纤维环细胞，培养１至７２小时。逡逑本实验所用的ＣｙＱＵＡＮＴ细胞增殖试剂盒是一个敏感性高、可重复并且简便的逡逑荧光微孔板检测的方法。其灵敏度较比色法分析更灵敏，且无放射性。细胞内逡逑１５逡逑
在每个时间点，ＰｏｌｙＰ处理组中的人纤维环细胞较对照组细胞逡逑数目有升高（Ｐ＜0．0５）。而且在不同时间点，ｌ．ＯｍＭＰｏｌｙＰ相比０．５ｍＭＰｏｌｙＰ组逡逑中细胞数要增多，但两组间并没有显著性统计学差异（Ｐ＞0．0５）（图２）。逡逑ＯｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑１０逡逑Ｈ？－０．５ｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑，９逦１ｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑专８逡逑８逡逑Ｏ邋７逡逑Ｉ６逡逑１邋ｈｏｕｒ邋３邋ｈｏｕｒｓ邋６邋ｈｏｕｒｓ邋１２邋ｈｏｕｒｓ邋２４邋ｈｏｕｒｓ邋４８邋ｈｏｕｒｓ邋７２邋ｈｏｕｒｓ逡逑图２．采用ＣｙＱＵＡＮＴ细胞X椫呈约练觳馊橄宋废赴脑鲋辰峁ｅ义希疲椋纾玻澹裕瑁邋澹颍澹螅酰欤翦澹铮驽澹幔睿酰欤酰箦澹妫椋猓颍铮螅酰箦澹悖澹欤戾澹穑颍铮欤椋妫澹颍幔簦椋铮铄澹幔悖簦椋觯椋簦澹鳎澹颍邋澹簦澹螅翦澹猓澹裕瑁邋义希茫眩眨粒危藻澹悖澹欤戾澹穑颍铮欤椋妫澹颍幔簦椋铮铄澹颍澹幔纾澹睿翦澹幔螅螅幔澹猓澹簦鳎澹澹铄澹簦瑁邋澹簦瑁颍澹邋澹纾颍铮酰穑螅义希保矗澄藁嗑哿姿嵫味韵宋废赴前肪厶牵ǎ牵粒牵┖铣傻挠跋戾义辖说南宋废赴萌植煌ǘ龋
本文编号：2815736
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R681.5
【部分图文】：
贴壁较对照组快；所有组细胞形态均正常，未见细胞形态不规则，胞核固缩。与逡逑对照组比较，０．５ｍＭ和ｌ．ＯｍＭ邋ＰｏｌｙＰ两组椎间盘纤维环细胞生长较快，胞质丰富，逡逑伪足伸出明显，但两处理组之间未见明显区别（图１）。逡逑３ｈｏｕｒｓ逡逑２４ｈｏｕｒｓ逡逑＞邋？邋？逡逑４８ｈｏｕｒｓ逡逑ｍ’逦：逦ｊ邋ｍ逡逑ＯｍＭ邋ＰｏｌｙＰ逦０．５ｍＭ邋ＰｏｌｙＰ逦ＩｍＭ邋ＰｏｌｙＰ逡逑图１．用不同浓度ＰｏｌｙＰ处理纤维环细胞后，倒置相差显微镜下观察不同时间点三组纤逡逑维环细胞形态学变化情况。逡逑Ｆｉｇｌ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｗｉｔｈ邋ＰｏｌｙＰ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｗｅｒｅ逡逑ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｕｎｄｅｒ邋ａ邋ｐｈａｓｅ邋ｃｏｎｔｒａｓｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ．逡逑１．４．２无机多聚磷酸盐对人纤维环细胞增殖活性的影响逡逑为了评估ＰｏｌｙＰ对人纤维环细胞增值的影响，并确定ＰｏｌｙＰ浓度与细胞增殖逡逑的关系，本实验中使用不同浓度ＰｏｌｙＰ处理人纤维环细胞，培养１至７２小时。逡逑本实验所用的ＣｙＱＵＡＮＴ细胞增殖试剂盒是一个敏感性高、可重复并且简便的逡逑荧光微孔板检测的方法。其灵敏度较比色法分析更灵敏，且无放射性。细胞内逡逑１５逡逑
在每个时间点，ＰｏｌｙＰ处理组中的人纤维环细胞较对照组细胞逡逑数目有升高（Ｐ＜0．0５）。而且在不同时间点，ｌ．ＯｍＭＰｏｌｙＰ相比０．５ｍＭＰｏｌｙＰ组逡逑中细胞数要增多，但两组间并没有显著性统计学差异（Ｐ＞0．0５）（图２）。逡逑ＯｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑１０逡逑Ｈ？－０．５ｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑，９逦１ｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑专８逡逑８逡逑Ｏ邋７逡逑Ｉ６逡逑１邋ｈｏｕｒ邋３邋ｈｏｕｒｓ邋６邋ｈｏｕｒｓ邋１２邋ｈｏｕｒｓ邋２４邋ｈｏｕｒｓ邋４８邋ｈｏｕｒｓ邋７２邋ｈｏｕｒｓ逡逑图２．采用ＣｙＱＵＡＮＴ细胞X椫呈约练觳馊橄宋废赴脑鲋辰峁ｅ义希疲椋纾玻澹裕瑁邋澹颍澹螅酰欤翦澹铮驽澹幔睿酰欤酰箦澹妫椋猓颍铮螅酰箦澹悖澹欤戾澹穑颍铮欤椋妫澹颍幔簦椋铮铄澹幔悖簦椋觯椋簦澹鳎澹颍邋澹簦澹螅翦澹猓澹裕瑁邋义希茫眩眨粒危藻澹悖澹欤戾澹穑颍铮欤椋妫澹颍幔簦椋铮铄澹颍澹幔纾澹睿翦澹幔螅螅幔澹猓澹簦鳎澹澹铄澹簦瑁邋澹簦瑁颍澹邋澹纾颍铮酰穑螅义希保矗澄藁嗑哿姿嵫味韵宋废赴前肪厶牵ǎ牵粒牵┖铣傻挠跋戾义辖说南宋废赴萌植煌ǘ龋
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