DATS对乳腺癌干细胞P-gp及NF-κB的表达调控及逆转ADM耐药性研究

发布时间：2020-09-14 13:59

　　目的:乳腺癌已经成为目前女性最高发的恶性肿瘤之一,并显示出了年轻化[1]。经手术放化疗后,肿瘤仍出现转移,多是由于肿瘤干细胞显示出的多药耐药性引起。耐药的肿瘤细胞中NF-κB的表达异常可能提示耐药性与NF-κB(nuclear factorκB,细胞核因子κB)之间可能存在某些联系[2]。NF-κB的下游基因中很可能有P-gp,当NF-κB被激活,P-gp蛋白表达增高从而引起癌细胞的耐药[3]。DATS(diallyl trisulfide,二烯丙基三硫化物,又称大蒜素),作用靶点多且高效低毒,在逆转耐药方面有良好前景[4]。本课题研究的为DATS逆转乳腺癌肿瘤干细胞耐药的作用,以及是否因抑制NF-κB的异常激活,从而对P-gp的表达产生抑制,由此逆转乳腺癌肿瘤干细胞的耐药。方法采用贴壁培养及球囊培养,加之流式细胞术检测MCF-7细胞株及MCF-7/ADM阿霉素耐药的细胞株中乳腺癌干细胞含量的比例;再使用球囊培养的方法富集MCF-7/ADM耐药株中乳腺癌干细胞;采用Annexin V联合7-AAD双染法检测DATS对MCF-7/ADM球囊细胞(乳腺癌干细胞)及贴壁细胞(乳腺癌细胞)毒性,以及使用DATS逆转耐药前后的ADM(阿霉素)对细胞毒性作用;Western Blotting检测DATS对P-gp以及EMSA方法检测NF-κB表达的调节,所有的数据统计使用SPSS17.0统计软件完成分析。结果:(1)MCF-7细胞以及MCF-7/ADM细胞的球囊生成率分别为1.13±0.55%和10.16±0.54%,流式细胞仪检测两种细胞株中CD44+CD24-细胞的比例分别为2.83±1.38%和63.94±2.31%。耐药株中的癌干细胞比例更高,两者差别有统计学意义。(以上P0.05,n=3)(2)DATS浓度为10、20μmol/L时MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊细胞凋亡率无统计学差异(P0.05),当DATS浓度为40、60、80μmol/L时,MCF-7/ADM球囊细胞凋亡率低于贴壁细胞,且差异具有统计学意义(P0.05,n=3)。当DATS浓度为60μmol/L作用24h后,细胞凋亡率明显增高。(3)在DATS浓度为10μmol/L作用下使用化疗药物5μmol/L ADM作用24h后,MCF-7/ADM的贴壁细胞与球囊细胞的凋亡率(41.07±0.29%、10.30±0.79%)明显高于单独使用化疗药物ADM细胞组(25.46±0.58%、5.42±0.31%),且差异具有统计学意义(P0.05,n=3)。经过撤药24h后,单纯化疗药物细胞组凋亡率下降,而联合DATS细胞组凋亡率有上升趋势,差别有统计学意义。并且球囊细胞加入DATS后化疗的敏感性相对上升。(4)MCF-7/ADM的球囊细胞较贴壁细胞有明显的P-gp及NF-κB表达;DATS作用于两种细胞后P-gp与NF-κB均被抑制,差异有意义(P0.05,n=3);在DATS作用下,使用化疗药物ADM 24h后,两组细胞的P-gp及NF-κB表达明显抑制更加显著,差异有统计学意义(P0.05,n=3)。(5)Western Blotting检测不同浓度的PDTC(NF-κB抑制剂)处理两种细胞24h后,10μmol/L DATS与不同浓度PDTC作用,两组细胞株P-gp表达抑制且呈浓度依赖,差别有统计学意义。40μmol/L PDTC联合DATS比0μmol/L PDTC联合DATS处理24h后对P-gp的表达有明显的抑制作用(P0.05);40μmol/L的PDTC与DATS一同处理两组细胞株0h、12h、24、48h后,P-gp有明显抑制且呈时间依赖,差别有统计学意义(P0.05)。结论:(1)耐药的乳腺癌细胞株可以富集出含量更高的肿瘤干细胞。(2)DATS可以逆转乳腺癌肿瘤干细胞对阿霉素的耐药作用。(3)P-gp和NF-κB的高表达与乳腺癌干细胞的耐药有关。(4)DATS干预NF-κB,能够部分抑制P-gp的高表达,逆转乳癌干细胞化疗耐药。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

散点图,球囊,细胞株

MCF-7/ADM球囊形成增高明显，而且耐药株每个球囊的细胞数明显多于MCF-7细胞株。第十日，MCF-7细胞株球囊为1.13±0.55%，MCF-7/ADM耐药细胞株球囊为10.16±0.54％，两者差异具有统计学意义(P＜0.001，n=3)。(见图2-1、表2-1)MCF-7细胞株 MCF7/ADM细胞株图2-1 十日后，MCF-7细胞株培养球囊细胞形成与MCF-7/ADM细胞株球囊细胞形成表2-1 秩和检验两组细胞株第十日球囊形成率（%）细胞株球囊形成率（%）MCF-7 1.13±0.55MCF-7/ADM 10.16±0.54t 值 20.258P 值 <0.0012.1.2 MCF-7 及 MCF-7/ADM 中 CD44+CD24-细胞所占比例用流式细胞术进一步检测 MCF-7与 MCF-7/ADM的球囊细胞 CD44+CD24-细胞所占比例，经检验发现前者球囊细胞中 CD44+CD24-细胞的比例明显低于后者。CD44-FITC 发射绿色荧光，CD24-PE 分发射橙红色荧光。CD44+CD24-细胞位于散点图的左上方绿色荧光强红色荧光弱的区域内。流式细胞仪检测两个细胞株中CD44+CD24-细胞的比例分别为 2.83±1.38％和 63.93±2.31％。差异具有统计学意义(P＜0.001，n=3)(见图 2-2、表 2-2)。

球囊,细胞,细胞株,比例

MCF-7 细胞株 MCF-7/ADM 细胞株图 2-2 MCF-7 球囊细胞和 MCF-7/ADM球囊细胞中CD44+CD24-细胞比表 2-2 t检验 MCF-7 的球囊细胞与 MCF-7/ADM 的球囊细胞中 CD44+CD24-细细胞株 CD44+CD24-细胞比例

曲线,贴壁细胞,球囊,χ2检验

图 2-3 不同浓度 DATS对 MCF-7/ADM 贴壁细胞和球囊细胞的 2-3 χ2检验不同浓度DATS 下MCF-7/ADM贴壁细胞与球囊L 10μmol/L 20μmol/L 40μmol/L 60μmol/L 32 8.04±0.32 10.25±0.14 14.83±0.24a19.60±0.31abc50 5.32±0.50 6.60±0.35 8.26±0.23d12.62±0.12abcdl/L比较，aP <0.05; 与同组 20μmol/L 比较，bP<0.05; 与同组 40μmol/L 比较较，dP<0.05

【参考文献】