MicroRNA-106a在骨肉瘤中的表达与增殖和侵袭相关性的研究

发布时间：2020-09-17 10:54

　　研究背景:骨肉瘤是儿童和青少年最常见的恶性骨肿瘤之一,在人体常好发于胫骨近端和股骨远端等长管状骨的干骺端,死亡率极高,随着新辅助化疗和手术在临床治疗中广泛应用,骨肉瘤5年生存率可达到50%-60%;然而,骨肉瘤早期症状隐匿,极易发生远处转移,约40%的骨肉瘤患者在确诊时存在肺部的微小转移,并提示预后不良,严重威胁着人类的生命和健康。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种内源性小非编码RNA,其长度位于20-24个核苷酸之间,miRNA主要与目标信使RNA(mRNA)的3'非翻译区结合以沉默目标基因表达。miRNA已被证实为转录后调节因子,在多种生理或病理过程中发挥重要作用。据研究,许多miRNA与细胞增殖,侵袭,凋亡及细胞周期有密切的关系。最近几项研究报道,microRNA-106a在人类几种不同类型的肿瘤中表达上调,参与了肿瘤的发生发展,侵袭和转移。因此,检测microRNA-106a在骨肉瘤中的表达水平并探讨其可能的靶点对于进一步探索骨肉瘤新的治疗具有重要意义。目的:检测microRNA-106a在骨肉瘤细胞中的表达水平,预测其与骨肉瘤增殖和侵袭有关的重要靶点,并通过实验来验证其靶点,探索可能的调控机制,为骨肉瘤的靶向治疗提供新的方向。研究方法:提取状态良好、处于对数生长期的骨肉瘤细胞U2OS及正常成骨细胞hFOB1.19的总RNA并逆转录成cDNA,采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测两者miR-106a的相对表达情况。运用介导含miR-106a抑制序列小干扰RNA或含miR-NC的无义序列小干扰RNA的慢病毒转染U2OS细胞,沉默miR-106a的表达,构建实验组(miR-106a-inhibitor)和对照组(miR-NC),把含miR-106a抑制序列的U2OS细胞作为实验组,把含miR-NC无义序列的U2OS细胞作为对照组,利用MTS增殖实验检测细胞的增殖,利用Transwell小室检测细胞的迁移及侵袭能力,利用流式细胞仪分析法检测细胞周期以及细胞凋亡率。细胞功能实验后,获取开放miRNA数据库(TargetScan,PicTarget和MicroCosm)进行生物信息学预测miR-106a靶基因。随后运用Western Blot和双荧光素酶报告基因来验证所预测的靶基因。结果:根据实时定量PCR结果显示,miR-106a的表达在骨肉瘤细胞系U2OS中相对正常成骨细胞hFOB1.19中显著上调(P0.01)。敲减掉miR-106a的表达后,对U2OS细胞的增殖、迁移和侵袭能力有抑制作用,流式细胞术检测细胞周期存在S期下调,G2/M期阻滞;流式细胞术检测细胞凋亡率上升。免疫印迹分析表明转染了miR-106a抑制序列的U2OS细胞中VNN2在蛋白水平表达高于阴性对照(miR-NC)组;实时定量PCR结果也表明转染了miR-106a抑制序列的U2OS细胞中VNN2在基因水平表达高于阴性对照(miR-NC)组。含有VNN2信使RNA3'非翻译区序列的萤光素酶报告验证VNN2即是miR-106a的结合靶点之一,这也进一步证实了生物信息学的预测。结论:敲除骨肉瘤中miR-106a的表达,可以提高VNN2的表达水平,诱导骨肉瘤细胞周期失调、增加细胞凋亡率,从而来抑制骨肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R738.1
【部分图文】：

统计图,慢病毒感染,视野,细胞

22图 2 慢病毒感染效率确认及验证A:代表慢病毒感染U2OS细胞72小时后，对照组和实验组在同一视野下的白光图和荧光图。细胞发出绿色荧光代表慢病毒感染成功，miR-106a-inhibitor成功介导入U2OS细胞内。所有细胞使用荧光倒置显微镜并在×400倍视野下观察拍照，B：统计图。慢病毒感染U2OS细胞72小时

慢病毒感染,细胞体,细胞,视野

中国医科大学硕士学位论文胞体外迁移和侵袭能力进行测试。使用倒置显微镜，对穿过 Transwell 上室，紧贴上室膜底侧的细胞进行拍照并计数。如图 4A 所示，转染 miR-106a-inhibitor 的 U2OS细胞相比转染 miR-NC 的细胞，穿过 Transwell 上室的细胞数明显减少；重复Transwell 实验三次，选取三次实验后镜下视野所见细胞进行计数统计得，沉默 U2OS细胞 miR-106a 的表达，穿过 Transwell 上室的细胞数明显减少（p < 0.05），U2OS细胞体外迁移和侵袭能力显著降低（图 4B）。

细胞周期分布,慢病毒感染,实验组,细胞数

26图 5 miR-106a-inhibitor 和 NC 细胞周期分布A:代表介导 miR-106a-inhibitor 和 NC 的慢病毒感染 U2OS 细胞 72 小时后，对照组和实验组的细胞周期分布图，B:统计图。对细胞各周期细胞数占全部细胞数的百分比进行统计分析。 *,实验组与对照组相比，P < 0.05。4.6 沉默 U2OS 细胞中 miR-106a 的表达能增加 U2OS 细胞的凋亡率。为了探讨慢病毒感染介导 miR-106a-inhibitor 后，细胞增殖、迁移及侵袭能力被抑制的机制，采用流式细胞仪分析实验组和对照组细胞凋亡率。细胞凋亡分析结果显示，沉默 miR-106a 的表达，可以增加 U2OS 细胞的凋亡率（图 6A）；进一步统

【参考文献】