Ghrelin对大鼠创伤性颅脑损伤后胃肠功能保护作用的机制研究

发布时间：2020-09-18 07:37

　　目的:创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是一种严重威胁人类健康的常见疾病。所有类型的创伤中死亡率和残疾率最高。是目前青壮年人群致残、致死的首要原因。欧美国家发病率高达150-200/10万人/年,我国达100-150/10万人/年。TBI后胃肠功能障碍主要临床表现有:一是胃肠黏膜缺血,这通常导致应激性溃疡和消化道出血;二是肠道屏障破坏,导致细菌和内毒素易位,导致全身性炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和败血症的发生;三是运动功能障碍,这表现为腹胀,腹泻,胃潴留,甚至毒性肠麻痹;四是导致胃肠黏膜对营养物质的吸收障碍,导致机体营养不良。对于前两方面TBI后胃肠黏膜损伤和肠道屏障破坏所致内毒素易位方面研究较多,但对于TBI后胃肠动力学研究少有报道。原因在于缺乏足够重视和对于胃肠动力学评价缺乏规范标准。大量研究表明TBI后患者营养状况与预后呈正相关。TBI患者不仅急性期脑组织和全身皆处于高代谢状态,而且康复期仍处于蛋白质高分解状态。TBI患者的静息能量消耗(resting metabolic expenditure,RME)显著高于非TBI患者,重度TBI患者的RME值是非TBI重症患者的240%,与烧伤体表面积达20%至40%的患者代谢状态相似。急性期TBI患者呈现高能量代谢状态,随着高分化代谢和免疫功能改变随之出现蛋白质过度分解,如无足够营养摄取,以支持患者急性欺恢复和后期康复的需求,将直接影响预后。临床上对于TBI患者的营养支持方式大都依靠肠内营养,而TBI后胃肠功能障碍将严重影响胃肠道对营养摄取,提高TBI后胃肠道功能障碍治疗水平以提高TBI的治愈率具有重要的临床意义。但目前对于TBI后胃肠动力学改变及其机制仍知之甚少。Ghrelin是参与胃肠运动调节的脑肠肽之一,具有多种作用。Ghrelin是否具有对TBI后胃肠道功能障碍有改善作用?机制如何?可否作为TBI后胃肠道功能障碍治疗手段之一,因此,本课题设计如下:(1)建立TBI后胃肠功能障碍动物模型,观察TBI后胃肠道改变;(2)观察给予Ghrelin干预后TBI后胃肠功能障碍的改变;(3)探讨Ghrelin对TBI后胃肠道功能障碍作用机制。方法:(1)选取成年健康雄性SD大鼠,建立大鼠TBI模型,大体观察、病理和胃肠动力检测,评估模型制作成功与否;(2)按照随机数字表法分为假手术组(Sham)、创伤组(TBI)、Ghrelin组(Ghrelin),Ghrelin组于伤后30min经大鼠尾静注入Ghrelin 20ug/kg,分别进行大鼠胃动力检测:胃内压检测、胃排空率、小肠推进率、粪便含水量百分比检测和胃内容物占体重的百分比检测,切取胃、距回盲部15 cm处小肠、回盲部(近端回肠肠管长约3 cm,远端3 cm结肠肠管长约3 cm),光镜和电镜下观察胃肠黏膜微观变化;(2)取假手术组(Sham)、创伤组(TBI)和Ghrelin组(Ghrelin)72 h脑皮质脑组织采用多通道蛋白芯片筛查蛋白表达水平,寻找差异蛋白。结果:成功建立大鼠TBI后胃肠功能障碍模型,并通过组织病理学和功能学进行验证。实验证明胃肠道功能障碍存在于大鼠TBI后。(1)依据神经功能缺陷综合评分量表测定各组神经功能改变,结果显示:TBI组和Ghrelin组6h神经功能缺损综合评分明显高于Sham组,有统计学差异(P0.01);而TBI组和Ghrelin组6h神经功能缺损综合评分无差异(P0.05)。TBI组和Ghrelin组24h、48h、72h神经功能缺损综合评分均明显高于Sham组,有统计学差异(P0.01);TBI组24h、48h、72h神经功能缺损综合评分也均明显高于Ghrelin组,有统计学差异(P0.01);(2)实验大鼠胃肠观察结果:Sham组大鼠可见肠壁呈粉红色,TBI组胃扩张,壁变薄,色苍白或暗红,小肠肠腔扩张、色泽灰暗,甚至瘀血,肠壁伴有大量黏液,可见明显的肠道胀气,仅有少量排出,即使术前禁食24 h在各时间点仍有胃内大量残余食物。Ghrelin组6 h组胃内残余食物与TBI组无明显区别但24 h后残余量明显减少。粪便含水量百分比结果显示:Sham组24h、48h、72h粪便含水量均高于TBI组和Ghrelin组,有统计学差异(P0.01);Ghrelin组24h、48h、72h粪便含水量也均高于TBI组,有统计学差异(P0.01)。大鼠胃内容物占体重百分比比较结果显示:TBI组24h、48h、72h胃内容物占体重百分比均高于Sham组和Ghrelin组,有统计学差异(P0.01);而Sham组和Ghrelin组24h、48h、72h胃内容物占体重百分比无差异(P0.05)。(3)TBI后72h电镜可见胃腺中的主细胞,细胞表面有散在的、短小的微绒毛。胞浆突出到腺腔,胞浆中可见大量的粗面内质网,排列不甚规则,线粒体局部肿胀,内可见髓样小体。胞浆内可见大量的内分泌颗粒,线粒体散在分布,肿胀,线粒体嵴变短变少,其内有髓样小体,Ghrelin组72h胃黏膜电镜下改变较TBI组明显好转。(4)多通道蛋白芯片结果:于72h取各组脑皮质组织采用蛋白芯片检测蛋白表达水平。与Sham比,TBI组有14个蛋白差异表达有统计学意义。Ghrelin干预后,其中b FGF蛋白表达水平明显下降。结论:本研究证实TBI后存在胃肠道功能动力障碍;Ghrelin能有效改善TBI后胃肠道黏膜显微结构和胃肠动力;初步证实Ghrelin改善TBI后胃肠动力障碍机制在于脑保护作用。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R651.15
【部分图文】：

大鼠,颅骨,皮肤,头皮

鼠测量体重后，按每 100 克×0.3 ml 的 10%水合氯醛进行腹腔内注暴露鼠腹腔注射麻醉成功后，将其固定在立体定向仪上，剃除头部皮切开头皮，剥离骨膜，于冠状缝后 5 mm，矢状缝右侧 5 mm交会5 mm骨孔，硬膜完整。将eCCI设置打击深度 3 mm、打击最低点持s、打击速率 5 m/s 打击后用缝合头皮。如有出血使用明胶海绵进模型制备完全后，等待大鼠出现夹尾反射后，将其固定至电子皮质损伤撞击仪深度 3 mm、打击最低点持续时间 200 ms、打击速率 5 m/s。以钻行打击，待无活动性出血后用生理盐水冲洗，碘伏消毒，逐层缝1）。

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TBI 后取材（A:大鼠脑组织右侧红色区损伤区域；B：肠组织；C：sham 胃组织；BI 后胃组织）.2 HE 染色.2.1 实验器材及试剂名称厂家型号脱水机佛山市亚诺精密仪器有限公司 CH150包埋机湖北泰康医疗设备有限公司 TKYTSI病理切片机上海泰维科技有限公司 TL-820冻台常州医疗电子有限公司 KY0405组织摊片机湖南迪亚仪器设备有限公司 KJP408烤箱上海泰维科技有限公司 DHG-9140A玻片及盖玻片武汉长生实验器材有限公司 34232C置光学显微镜上海仪圆光学厂 CX31

颅脑损伤,创伤性,后脑,HE染色

Sham 8 1.54±0.03 1.37±0.04 1.92±0.05 1.70±0.05TBI 8 34.89±1.57 20.50±1.84 16.53±1.21 14.46±1.30t 60.071 29.399 34.122 27.742P 0.000 0.000 0.000 0.000伤性颅脑损伤脑组织观察组织观察结果：Sham组各时相点神经细胞形态结构正常。TBI 组伤后 4A），大鼠脑皮质可见散在变性坏死的神经元，可见大鼠皮质中的神散在的变性和坏死。神经元细胞体呈三角形收缩，细胞质着色减少，色加深；在损伤后24小时在大脑皮层中观察到较为广泛神经元变性坏细胞出现核溶解和空泡化，神经元存活数量明显减少，细胞间隙增宽有大量水肿（图 4B）；伤后 72h 仍可观察到广泛水肿和神经元变性（图 4D）。

【参考文献】