脂肪细胞的分泌功能影响脱细胞血管支架在动物体内钙化进程的研究

发布时间：2020-09-18 08:49

　　第一部分异种与同种动脉脱细胞血管材料在大鼠体内的免疫反应及钙化表现目的:先天性心脏病(Congenital Heart Disease,CHD)是最常见的先天性出生缺陷,随着我国放开二胎政策以及产检、手术水平的增加,预计先心病患儿数量逐年增多。CHD常需要应用不同材质、不同口径的血管材料进行手术治疗,然而目前市面上的血管或瓣膜材料都会在患者体内产生炎症反应从而钙化衰败。本研究期望探索有效的脱细胞血管材料的建造方法。通过大鼠皮下模型,来评价同种脱细胞血管材料和异种脱细胞血管材料在动物体内的炎症反应,以及钙化情况,从而初步了解两种材料引起机体免疫反应及钙化的相关性。方法:取供体大鼠的颈动脉材料约5cm,以及猪颈动脉5cm,将血管材料裁剪成0.5×0.5cm的血管片。用胰酶法对血管材料进行脱细胞处理,并且对脱细胞水平进行鉴定。将符合标准的血管材料冻干保存。用胰酶法制作猪颈动脉和大鼠降颈动脉脱细胞血管材料,并且对脱细胞水平进行鉴定。实验组在6周龄SD大鼠皮下植入同种脱细胞血管材料(N=6);对照组6周龄SD大鼠皮下植入猪颈动脉脱细胞血管(N=6),每只四个位点。两组内取材时间分别为血管移植后2周和4周。通过HE染色、天狼星红染色、免疫荧光染色、免疫组化以及Von Kossa硝酸银法检查材料于动物体内移植后的再细胞化及钙化情况是否有差异。结果:(1)脱细胞镜下结果显示,胰酶法脱细胞处理的血管材料没有细胞核残余,血管材料外观形态基本正常。猪脱细胞血管DNA平均光密度值为(4.59±0.49),未经脱细胞血管处理的猪血管DNA光密度值(564.35±26.13)。同种脱细胞血管DNA平均光密度值(5.45±0.24),处理前的同种血管DNA光密度值(497.1±7.12)。表明该处理方法可以有效去除血管组织中的细胞成分。(2)天狼猩红染色显示2h胰酶的处理的血管组织绿色弹性纤维缺失断裂明显,表明血管外膜、中膜弹性纤维有明显损害。胰酶处理1h,Ⅰ、Ⅲ型弹力纤维波浪状结构保存相对完好。0.05%胰酶浓度37℃处理1h的血管材料能够有效去除细胞成分,并且保留较好的血管弹性纤维形态。(3)两周后从大鼠体内取出血管,血管移植物基本保持原有形状外观,没有分解的征象,外边可见包裹的纤维组织。HE染色可见大量的自体细胞渗入脱细胞血管的纤维蛋白支架内。每个时间点两组血管细胞渗入数量均有明显差异(二周P=0.023,四周P=0.019)。宿主细胞通过血管两侧的断裂位置渗入的程度更深,数量更多。在远离断端的靠近血管壁中心的位置,细胞渗入主要发生在内外膜(行进方向为血管横截面方向),渗入速度较血管断端慢。4周的皮下植入,可以见到包裹血管的纤维组织中有滋养血管生长,包裹血管材料周围的纤维组织内也布满自体细胞,自体组织与移植血管组织没有明显界限,需要通过移植组织的弹性纤维条状形态进行区分。(4)细胞免疫荧光染色发现,同种脱细胞血管中引起的巨大多核巨噬细胞的数量少于异种脱细胞血管。二周时同种脱细胞血管镜下的多核巨噬细胞渗入个数为 1.60± 1.70 个/7.6*104μm2,异种脱细胞血管为 2.14±1.64 个/7.6*104μm2,两组没有显著性差异(P=0.055)。四周时,多核巨噬细胞渗入增多,同种材料中6.58±2.72个/7.6*104 μ m2,异种材料中7.85±3.15个/7.6*104 μ m2,两组有显著性差异(P=0.012)。镜下可见,巨大多核的巨噬细胞多出现于血管材料表面,难以渗入血管材料内部。CD68免疫组化染色的巨噬细胞明显聚集于血管内外膜接触表面,提示血管与自体组织接触表面发生着巨噬细胞介导的炎症反应。(5)钙化染色结果发现,4周时,两组的钙化镜下未见明显差异,原子火焰法检测钙化2周时同种脱细胞血管钙化为1.08±0.34μg/mg,异种脱细胞血管钙化为1.23±0.32μg/mg(P=0.44);4周时同种脱细胞血管钙化为1.75±0.34μg/mg,异种脱细胞血管钙化为3.06±0.30μg/mg(P0.01)。同种脱细胞血管的钙化程度两周、四周时均明显轻于异种血管组。结论:通过0.05%胰酶、SDS、Triton的化学消化法可以制作脱细胞率达99%以上的细胞外基质。同种或异种脱细胞血管支架,虽然去除了 99%以上的细胞成分,在动物体内实验仍然引起以巨噬细胞为主的炎症细胞聚集。同种脱细胞血管支架在动物体内引起多核巨噬细胞的数量明显少于异种脱细胞血管支架。同种脱细胞血管支架在动物体内4周引起的钙化程度明显小于异种脱细胞血管支架。脱细胞血管的钙化反应与巨噬细胞介导的免疫炎症反应明显相关,然而具体机制仍需要进一步探究。第二部分脂肪干细胞体外分化得到的脂肪细胞分泌功能的鉴定目的:种子细胞的应用在血管组织工程里十分普遍,他们可以通过自身分泌的活性因子改变血管材料局部微环境,改善机体细胞对材料的细胞免疫反应,引导材料重塑。正常体内血管周围是存在密集结缔组织和脂肪组织包裹的,血管周围的脂肪细胞分泌功能影响着血管钙化的病理生理过程。然而对于脂肪细胞的培养,没有标准流程,本研究拟从大鼠腹股沟脂肪组织中提取脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探索其分化为脂肪细胞的条件,并且检测其分泌抗钙化因子的能力。为将来在组织工程血管中的应用提供基础支持。方法:通过Ⅰ型胶原酶消化法提取大鼠腹股沟脂肪干细胞,并在光镜下进行形态学观察,应用流式细胞学对P3代进行表型检验。对P1、P2、P3、P4、P5代均进行成脂分化培养,比较哪一代ADSCs分化为脂肪细胞的效率较高,油红0染色,计数统计成脂分化率。取出P3代ADSCs细胞进行成脂分化培养,免疫酶联染色法检测ADSCs和分化来的脂肪细胞分泌脂联素(Adiponectin,APN)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的能力,设立标准品,做标准曲线,通过曲线计算样品浓度。细胞计数由两人不知道分组的情况下完成。结果中的数据以“均数±标准差”形式表示,两组间比较用T检验。多组间比较用ANOVA单因素方差分析,两两比较用LSD检验。使用SPSS.20.0进行统计分析,P0.05被认为有统计学差异。结果:提取细胞经过24-48小时后开始贴壁,于5-7天开始形成集落或团簇生长,7天基本达到80%融合,细胞形态均一成长梭型外观,细胞排列紧密形成典型旋涡状结构。传代到P3代对细胞表型进行检测:少于3.6%的细胞表达造血干细胞表面因子CD34;CD29,CD166间质细胞表面标志,均有60%以上的表达;边缘型造血干细胞表面抗体ABCG2表达约为42%,与以往文献报道相符,可以确定提取成功ADSCs。对P3,P4,P5代进行成脂分化7天的平均成脂分化率分别为61.6± 15.4%、57.23±6.7%、55.8±12.96%,均高于55%,然而P1、P2成脂分化率分别为9.06±4.82%、35.6±12.1%,均低于35%(P0.05)组间具有显著差异。虽然P3,P4,P5代两两无显著性差异,但与镜下可见P4、P5成脂分化出现较多细胞漂浮缺失部位,而P3代细胞贴壁情况良好。表明在第P3代的ADSCs诱导来的脂肪细胞成脂分化效率较好,成脂分化过后,漂浮死亡细胞较少。免疫酶联方法检测结果表明脂肪细胞可以大量分泌APN(67.86±2.36 ng/ml/天)、VEGF(757.91±21.83 pg/ml/天)HGF、(261.8±21.6pg/ml/天)。ADSCs 分泌的 APN(低于 1.56ng/ml/天)、VEGF(214.01±11.61 pg/ml/天)相对脂肪细胞分泌功能较低(P0.01)。结论:脂肪来源的干细胞可以成功分化为具有分泌大量抗炎症因子APN和血管再生因子VEGF和HGF的脂肪细胞。脂肪干细胞的P3代在分化7天后达到成脂分化率较高。第三部分分化来的脂肪细胞的分泌功能影响异种脱细胞血管在动物体内的炎症及钙化反应目的:心外科血管移植材料到患者体内后,经历着一系列新细胞的长入以及免疫炎症因子的作用,其中巨噬细胞介导的炎症反应以及磷酸盐沉积与移植血管的钙化密切相关。故对于免疫炎症的干预可能是减轻材料钙化途径。体内外的研究均表明,脂联素(Adiponectin,APN)具有抑制钙化的作用。鉴于脂肪细胞可以分泌大量APN和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),还有肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的能力。本实验希望通过诱导脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)分化为脂肪细胞(Induced Adipocyte Cells,IACs),并且用温度反应性培养皿建立脂肪细胞片(Induced Adipocyte Cell-Sheets,IAC-S),直接粘附于脱细胞血管材料型工程血管材料。检测IAC-S在体内的分泌功能,以及对脱细胞血管材料炎症及钙化的影响。方法:用我们以前的方法建立脱细胞猪颈动脉血管材料,并对脱细胞有效性进行检测,裁剪成1.0×1.0厘米大小的血管片,冻干备用。对实验组大鼠腹股沟脂肪干细胞的提取并且传代培养,并且将P3代细胞种植于温度反应性培养皿上,融合至80%时进行成脂肪细胞分化,建造脂肪细胞片。对脂肪细胞片的分泌APN、VEGF、HGF的分泌功能进行鉴定。应用转移膜将IAC-S完整转移并且粘附在猪脱细胞血管材料外膜,制作成IAC-S处理的脱细胞血管材料。实验组将IAC-S血管(N=6)移植于相应的供体大鼠,对照组移植猪颈动脉脱细胞血管(N=6),1、2、4、8周时,依次取出每个位点移植物。分别做HE染色、免疫荧光染色、Von Kossa硝酸银染色、以及原子火焰法检测材料钙含量检测。连续变量符合正态分布时以均数±标准差表示;不符合正态分布用四分位数表示;采用独立样本T检验方式或非参数检验。比较两组巨噬细胞(Macrophage)渗入数量以及分型(Macrophage 1,M1;Macrophage 2,M2),M1/M2比值,钙化程度。P0.05表示差异有显著性。统计分析采用SPSS20.0软件。结果:(1)成功通过胰酶法制做出来了脱细胞猪颈动脉材料。(2)大鼠腹股沟脂肪组织能够成功分离、诱导培养出具有分泌功能的脂肪细胞。通过温度反应性培养皿,我们可以建造出完整的IAC-S。通过细胞转移膜,可以把IAC-S转移到脱细胞血管材料表面,构成贴和IAC-S的脱细胞血管材料。(3)免疫酶联染色法可以检测到APN和VEGF分泌量在成脂分化过后明显增高:APN由低于1.56ng/ml/细胞片/天升高到70.25±6.1 ng/细胞片/天(P0.01);VEGF 由 226.93±40.72 pg/细胞片/天升高到 805±25.92 pg/细胞片/天(P0.01)。然而 HGF 分泌量由 368.9±31.02 pg/细胞片/天降低到265.39 ± 10.74pg/细胞片/天(P0.01)。(4)免疫荧光染色表明IAC-S在移植一月后仍具有分泌APN的能力。(5)在第4和8周,单纯脱细胞血管组中,CCR7+细胞(M1)明显高于CD163+细胞(M2)的比例(P0.001),并且第8周时多核巨噬细胞明显增多。然而,IAC-S处理组的血管材料中,M2型巨噬细胞相对于M1型则占有较大比例(P0.001)(5)脱细胞血管组的M1/M2均大于1,每个时间点的促炎型M1巨噬细胞均多于M2抗炎巨噬细胞;而IAC-S组M1/M2均小于1,每个时间点的抗炎型M2巨噬细胞均多于M1促炎巨噬细胞。(6)单纯脱细胞血管组的钙化程度明显升高,两组在2、4、8周的取材均有统计学差异性(P0.05)。结论:温度反应性培养皿可以成功建立具有分泌功能的脂肪细胞片,该脂肪细胞片在体内外均能分泌APN、VEGF、HGF因子。脂肪细胞片覆盖的脱细胞血管支架在动物体内能够引起渗入的巨噬细胞表型的改变,使得M2抗炎型巨噬细胞比例增高,并且钙化程度明显降低。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08;R654
【部分图文】：

动脉,胰酶,弹性纤维

用相同试剂作为空白对照，以ＧＢＷ（Ｅ）０８０２６１为标准品（购自国家标准物质逡逑商城）作质量控制。逡逑５．统计分析逡逑结果中的数据以“均数土标准差”形式表示，两组间比较用Ｔ检验。多组间比逡逑较用ＡＮ０ＶＡ单因素方差分析，两两比较用ＬＳＤ检验。使用ＳＰＳＳ．邋２０．邋０进行统计分析，逡逑Ｐ＜0．邋０５被认为有统计学差异。逡逑结果逡逑１．脱细胞处理镜下结果逡逑脱细胞处理完的血管材料通过ＨＥ染色可以观察到基本没有细胞核残余，外观逡逑形态基本正常（见图二），图一为脱细胞前，正常猪颈动脉血管。天狼猩红染色观逡逑察胰酶处理１小时及２小时造成的纤维蛋白变化情况，显示２ｈ胰酶的处理的血管逡逑组织绿色弹性纤维缺失断裂明显，表明血管外膜、中膜弹性纤维有明显损害。胰酶逡逑处理ｌｈ，Ｉ、ＩＩＩ型弹力纤维波浪状结构保存相对完好。逡逑

动脉,胰酶,弹性纤维,统计分析

标准曲线,胰酶,动脉,血管

图３胰酶处理１小时猪颈动脉天狼星红染色图４胰酶处理２小时猪颈动脉天狼猩红染色逡逑（Ｉ型弹性纤维呈橘红色，ＩＩＩ型弹性纤维绿色。图三，图四）。逡逑２．脱细胞处理后组织血管ＤＮＡ检测结果逡逑通过测量ＤＮＡ标准品的吸光度，计算所得回归方程为Ｙ＝０．８７４６Ｘ＋３．０７（ｒ＝０．９９８５），线性范围为１－５００ｎｇ／ｍｌ。计算得到提取的猪脱细胞血管ＤＮＡ平均密度值为（４．邋５９±０．邋４９），未经脱细胞血管处理的猪血管ＤＮＡ光密度值（５６４．邋３５２６．邋１３）。同种脱细胞血管ＤＮＡ平均光密度值（５．４５±０．２４），处理前的同种血管ＤＮ光密度值（４９７．邋１±７．邋１２）。相应ＤＮＡ浓度见图，结果说明，脱细胞处理有效彻底，逡逑基本去除血管原有ＤＮＡ物质。逡逑ＴＮＥ缓冲液溶解ＡＤＮＡ标准曲线逦处理对后两组ＤＮＡ浓交较逡逑６00邋６００邋逦逦逡逑４９６．邋６５逡逑５００邋Ｍ３Ｔ．Ｓ３逦逡逑ｉ邋４００邋￣ｍ￣＼逦逦逡逑３００逦＊逦Ｒｆ｜逦0猪血苷组逡逑２逦＾邋３００邋一邋Ｈ邋逦邋0邋同种ｆｌ？组逡逑、逦Ｉ－，逦逡逑１00邋—逦

【相似文献】