严重烧伤后肠黏膜屏障损伤的机理及防治研究

发布时间：2020-09-18 12:36

　　一、研究背景机体正常的肠粘膜屏障主要由机械、免疫及生物屏障三部分构成,机械屏障是由肠黏膜上皮细胞的紧密连接形成的,可阻止细菌和内毒素的侵入;免疫屏障是肠粘膜淋巴组织形成的,通过细胞免疫和体液免疫作用,阻止致病性抗原对机体的伤害;生物屏障是由肠道菌群与肠黏膜紧密结合形成的,可阻止肠道中条件致病菌的定植和入侵。在正常情况下,由于胃肠道黏膜屏障的保护作用,机体免受肠腔内细菌和内毒素的侵袭。而在严重烧伤后的急性应激反应条件下,由于血液的重新分配,肠道极易缺血缺氧。胃肠粘膜由于急性的缺血缺氧导致肠黏膜屏障受到破坏,引发细菌和内毒素的移位,从而导致肠道细菌移位到血液循环即肠源性感染的发生。这也是导致烧伤后SIRS和MODS发生的重要因素。因此,严重烧伤后防治肠黏膜屏障的损伤就成为了烧伤研究的热点之一。目前针对严重烧伤后机械屏障和免疫屏障损害的机理已有较多研究,但是关于生物屏障损害机理的研究较少。因此,本实验通过观察大鼠严重烫伤后肠道菌群发生的变化,从而了解肠黏膜生物屏障损害的情况,提出针对性的防治策略;本课题还根据严重烧伤后肠黏膜三个屏障损伤发生的机制,早期喂养对三个屏障均有保护作用的营养物质,从而证实严重烧伤病人早期喂养混合营养剂有助于保护肠粘膜屏障的完整性。二、研究目的,1.通过对严重烫伤大鼠的粪便16S r RNA宏基因组测序,研究严重烫伤后大鼠肠道生物屏障的变化。2.探讨早期口服混合肠内营养剂对严重烧伤病人肠黏膜屏障的保护及修复作用。三、资料和方法1.第三军医大学动物中心提供SD大鼠10只,体重(200~220)g,10只大鼠在烫伤前3天,给予正常喂养(饮水和食物),未予其他处理。分别于烫伤前和烫伤后的前三天,无菌镊子收集新鲜粪便于无菌便盒内,分别标记为烫伤前和烫伤后。后提取烫伤前后各组粪便dna,pcr扩增16srrna(v3-v4)区,运用高通量miseq测序平台进行基因测序。具体测序内容如下:①大鼠肠道菌群otu(操作分类单元)聚类:根据序列之间97%的相似性作为阈值,分成otu来分析微生物的多样性。②物种分类:采用rdpclassifier对每条序列在门、纲、目、科、属水平上进行物种分类,覆盖率(其数值越高,则样本中序列没有被测出的概率越低)80%为阈值对每个样本和每个物种单元分类进行序列丰度(数量)计算,构建样本和物种分类单元序列丰度矩阵。③alpha多样性的分析:计算组内各样本的物种多样性(richnessindex、shannonindex、ace指数、chao1指数),衡量样本物种多样性。④beta多样性分析:分析样品间的差异,选取具有代表性的序列与16srrna的关键序列进行比较,依照多序列队列构建具有代表性的序列作为节点的发育树,运用unifracmetric加权重(计算不仅评估样本间物种的差异,并且加入了物种丰度(数量)作为权重)方式来衡量样品间的距离、样品的聚类树及样品的pca。统计运用spss16.0对数据行配对t检验分析。2.选择第三军医大学西南医院烧伤研究所2013年8月至2014年9月收治且符合纳入标准的24例烧伤病人,随机将病人分为常规治疗组和早期肠内喂养组,每组各12例。常规治疗组病人于伤后24h内起接受常规治疗,早期肠内喂养组于相同时相点在常规治疗基础上口服含有谷氨酰胺、益生菌、益生元的混合肠内营养剂100ml,连续喂养7天。分别于入院时及喂养后第1日、第3日、第7日、第14日、第21日检测病人血清二胺氧化酶(dao)、血清降钙素原(pct),血浆内毒素(lps)水平及创面分泌物和血液微生物学培养,观察伤后21日内有无发生mods。统计运用spss16.0对数据行fisher确切概率法、lsd-t检验、重复测量方差分析及秩和检验。四、结果1.严重烫伤后大鼠肠道生物屏障变化的研究:①otu(操作分类单元)聚类分析:大鼠烫伤前后肠道菌群的otu结果差异无统计学意义(p值均大于0.05)。说明烫伤前后大鼠肠道菌群的种类组成没有发生改变。②物种分类:烫伤前后大鼠肠道菌群的种类丰度(数量)有明显差异。其中有益菌厚壁菌门数量相比较烫伤前明显减少,致病菌变形菌门数量相比较烫伤前明显增多,差异有统计学意义(p值均小于0.05)。说明烫伤后肠道有益菌种数量减少,致病菌种数量增多。③alpha多样性分析:烫伤前和烫伤后两组样品组内相比较差异无统计学意义(p值均大于0.05)。说明两组样品均具有良好的多样性,也证明了实验数据的可靠性。④beta多样性分析:烫伤前后两组样品组间各自形成聚类,具有各自的特征。说明烫伤后肠道菌群多样性发生了变化,且改变主要体现在物种丰度(数量)方面。2.严重烧伤早期口服肠内营养剂对肠黏膜屏障保护的临床研究①血清DAO水平:早期肠内喂养组病人于喂养后第7日、第14日及第21日血清DAO水平均明显低于常规治疗组(P值均小于0.05);其余时相点组间结果差异无统计学意义(P值均大于0.05)。②血清PCT水平:早期肠内喂养组病人于喂养后第7日、第14日血清PCT水平均明显低于常规治疗组(P值小于0.05或P值小于0.01);其余时相点组间结果差异无统计学意义(P值均大于0.05)。③血浆LPS水平:早期肠内喂养组病人血浆LPS水平于喂养后第7日明显低于常规治疗组(P值小于0.05);其余时相点组间结果差异无统计学意义(P值均大于0.05)。④血液和创面微生物培养:常规治疗组和早期肠内喂养组血液细菌学培养呈阳性结果分别有7例、1例,差异有统计学意义(P值小于0.05),且常规治疗组有2例培养出肠道常驻菌。两组病人创面微生物培养阳性结果差异无统计学意义(P值大于0.05)。⑤MODS发生情况:常规治疗组病人有1例发生MODS,而早期肠内喂养组病人中未发生MODS。组间比较差异无统计学意义(P值大于0.05)。五、结论1.严重烫伤后大鼠肠道菌群的种类组成没有发生改变,但有益菌厚壁菌门的数量相比较烫伤前明显减少,致病菌变形杆菌门的数量较烫伤前明显增多,表明大鼠严重烫伤后发生了肠道菌群紊乱,肠黏膜的生物屏障受损。2.严重烧伤病人早期加用混合肠内喂养剂,可保护和修复肠黏膜屏障的功能,减轻炎症反应,从而降低肠源性感染的发生,改善严重烧伤病人的预后。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R644

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