氢气对miR-29家族的调控作用及其发挥深低温停循环脑保护作用的分子机制研究

发布时间：2020-09-27 14:06

　　 目的:通过建立一种低温糖氧剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)HT22细胞模型来模拟深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest,DHCA)诱导的脑细胞损伤,从而探究氢气对损伤HT22细胞内miR-29家族的调控作用,进一步研究miR-29家族在低温OGD/R相关性脑细胞损伤上的效应和相关机制。方法:将HT22细胞随机分为10组:(1)对照组;(2)低温OGD/R组;(3)低温OGD/R+氢气组;(4)miR-NC组;(5)agomiR-29a/b/c组(5-7);(6)antamiR-29a/b/c组(8-10)。运用一个密闭容器和一个厌氧产气袋建立低温OGD/R模型;定量PCR检测各组HT22细胞内miR-29家族的表达;CCK-8试剂盒检测细胞活性;western blot检测HT22细胞内KEAP1、NRF2、BAX和PUMA蛋白含量;JC-1和H2DCFDA试剂盒分别测定HT22细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);双荧光素酶报告分析实验来验证miR-29家族的下游作用靶点。结果:我们发现氢气能够显著增加OGD/R相关性HT22细胞内miR-29家族的表达;将miR-29家族类似物转染至受损HT22细胞后,脑细胞损伤显著减轻:活细胞数目增加,ROS含量减少,MMP下降减轻,氧化应激相关蛋白KEAP1和凋亡相关蛋白PUMA、BAX表达下降,抗氧化应激相关蛋白NRF2表达增加;双荧光素酶报告分析实验结果表明miR-29家族能够直接靶定促凋亡蛋白PUMA,并抑制其表达。结论:氢气的脑细胞保护效应与其能够上调miR-29家族的表达密切相关,且miR-29家族可以通过作用于一种促凋亡BCL-2家族成员-PUMA,从而对DHCA介导的神经元损伤产生保护性作用。目的:探究富氢盐水(hydrogen rich saline,HRS)对DHCA大鼠海马组织内miR-29家族的调控作用;进一步研究miR-29家族类似物对DHCA大鼠脑损伤的效应和相关机制。方法:运用改良Pulsineli四血管阻断法来建立DHCA大鼠模型;通过微量注射器和立体定位仪将miR-29家族合成物注射到大鼠海马组织中;运用定量PCR法来检测各组海马组织中miR-29家族的表达量;运用组织病理学方法来观察DHCA相关性海马神经元的形态特征;运用特定试剂盒来测定大鼠海马组织和血清中相关炎性因子和氧化因子含量,western blot检测海马组织中Caspase-3,BAX,PUMA,KEAP1和NRF2蛋白的表达。结果:HRS能够显著上调DHCA大鼠海马组织内的miR-29家族表达;在大鼠海马组织中注入miR-29家族合成物后,DHCA大鼠脑损伤显著减轻:海马细胞凋亡减少,海马CA1区细胞组织病理学特征改善,海马组织和血清中MDA含量和NOS活性下降,SOD活性增加,炎性因子TNF-α以及IL-1β含量降低,抗炎因子IL-10含量增加,氧化应激相关蛋白KEAP1和凋亡相关蛋白Caspase-3、PUMA、BAX表达下降,抗氧化应激相关蛋白NRF2表达增加。结论:富氢盐水在DHCA大鼠中的脑保护效应与其能够上调miR-29家族的表达密切相关,且miR-29家族能够通过抗凋亡,抗炎和抗氧化作用来发挥保护性效应。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R61
【部分图文】：

OGD6h/R6h/12h/24h 培养后，细胞开始出现大量凋亡形态，其中 OGD6h/R6h 最适合后续干预处理。图1 不同再灌注条件下HT22细胞的典型形态学图像。

上海交通大学医学院2.2 氢气可以显著抑制低温糖氧剥夺/再灌注（OGD/R）诱导的 HT22细胞中的 miR-29 家族表达下降首先将 HT22 细胞进行低温 OGD 处理 6 小时，然后恢复正常培养 3 小时/6 小时/18 小时即R3h/6h/18h。运用实时定量 PCR 的方法检测各个组别细胞中的 miR-29a/b/c 表达量，发现随着再灌注时间的延长，miR-29 家族表达量逐步降低（图 2A）。但是当用 75%氢气处理损OGD6h/R6h 诱导的 HT22 细胞时，miR-29 家族的表达显著上调（图 2B）。

21图 3 miR-29a/b/c 对照剂、类似物和抑制剂在低温 OGD6h/R6h 相关性 HT22 细胞增殖上的效应。A 在转染 miR-29 家族合成物 48 小时后，HT22 细胞接受低温 OGD6h/R6h 处理所显示出的典型形态学变化。B 各组 HT22 细胞在 450nm 波长下的荧光值柱状统计图。比例尺 100μm。N=6; **, p<0.01。

【参考文献】

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本文编号：2827971