膜联蛋白A3在骨肉瘤细胞系HOS中的表达及意义

发布时间：2020-09-27 17:57

　　目的:探讨膜联蛋白A3(Annexin A3、ANXA3)在骨肉瘤细胞系HOS与成骨细胞系中的表达差异及意义,寻求针对骨肉瘤靶向治疗的新方法。方法:首先应用细胞免疫荧光证实ANXA3是否在骨肉瘤细胞中表达,再采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法分别检测ANXA3在成骨细胞系及骨肉瘤细胞系HOS和U2OS细胞中的表达水平,再通过脂质体介导的方法将小干扰RNA(siRNA)转染到HOS细胞系中,下调HOS细胞系中ANXA3的表达。将siRNA转染进HOS细胞6小时后通过荧光显微镜观察siRNA转染进入HOS细胞情况,转染48小时后收集细胞,提取细胞中总蛋白后通过Western blot法检测转染48小时后HOS细胞中ANXA 3的蛋白表达情况,确定ANXA3在骨肉瘤细胞系HOS中表达下调,再通过流式细胞术检测转染前后HOS细胞的凋亡率。结果:1.通过激光共聚焦显微镜观察到ANXA3在骨肉瘤细胞中表达;2.通过RT-PCR、Western blot检测成骨细胞与骨肉瘤细胞中ANXA3表达量,发现ANXA3在骨肉瘤细胞系HOS及U2OS中RNA水平和蛋白表达水平均较成骨细胞系显著升高、而HOS中ANXA3的水平升高更明显;3.将3种si RNA转染至HOS细胞系后,通过Western blot检测HOS细胞的转染效率,结果显示各实验组ANXA3表达均明显下调;4.通过流式细胞术检测转染前后HOS细胞的凋亡情况,结果显示转染后各组凋亡率较转染前均明显增加。结论:ANXA3在骨肉瘤细胞系中高表达,下调HOS细胞中ANXA3的表达可使其凋亡增加。
【学位单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R738.1
【部分图文】：

细胞,成骨细胞,细胞形态

（90%培养基+10%DMSO 或 90%血清+10%DMSO）均匀吹散细胞，用移液器轻轻移入准备好的冻存管中。用封口膜封裹瓶口并标记好，依次放入4 ℃ 30min、-20 ℃ 30min、-80℃过夜（也可直接装入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱），之后存放于液氮中长久保存。细胞复苏时应遵循快速复苏原则，复苏时应尽快在水浴锅中将细胞解冻。首先将完全培养基置于恒温水浴箱（37℃）预热 30min 备用。之后取7ml 培养基置于 25cm2细胞培养瓶中。随后带保暖手套小心从液氮罐中取出冻存的细胞，立即放入 37℃水浴锅中，并不断轻轻摇晃，使冻存管中细胞悬液尽快融化。然后迅速将细胞悬浮液移入至高压灭菌过的细胞培养瓶中，轻轻晃动培养瓶，使细胞均匀散开，在显微镜下观察细胞状态，随后将培养瓶放入孵育箱中。

骨肉瘤,细胞系,激光共聚焦显微镜,细胞融合

2 结果2.1 激光共聚焦显微镜观察膜联蛋白 A3 在骨肉瘤细胞中表达本实验通过细胞免疫荧光初步检测细胞系 HOS、U2OS 中 ANXA3 的达情况，证实细胞中 ANXA3 在骨肉瘤细胞系中表达。图 a 显示红色为蛋ANXA3 的表达情况，图 b 为细胞核染，图 c 为细胞融合图，从图 1、图中我们可以明显看出 ANXA3 在细胞系 HOS、U2OS 中表达。（图 2、图

骨肉瘤,成骨细胞,细胞系,存在差异

图 3. 激光共聚焦显微镜检测骨肉瘤 U2OS 细胞中 ANXA3 的表达a. ANXA3 表达情况;b.细胞核染色;c.细胞融合Figure 3. Laser confocal microscopy to detect ANXA3 expression in osteosarcoma U2OS cellsa.ANXA3 expression; b.Nuclear staining; c.Cell fusion2.2 RT-PCR 检测膜联蛋白 A3 在成骨细胞及骨肉瘤细胞中的表达通过细胞系 HOS、U2OS 的细胞免疫荧光实验，我们得知骨肉瘤细系中 ANXA3 是表达的，为了验证成骨细胞与骨肉瘤细胞系中 ANXA3 的体表达情况与是否存在差异，本实验通过 RT-PCR 从基因水平检测表达情及是否存在差异，实验结果显示与成骨细胞对照组相比，HOS 细胞系U2OS 细胞系较成骨细胞组明显升高，其中在 HOS 细胞系中升高更明显

【参考文献】