人体脂肪细胞外基质可注射水凝胶支架的构建及相关性能研究

发布时间：2020-09-28 08:25

　　目的:软组织缺损的修复重建一直是整形外科所面临的难题和挑战,目前临床常用的软组织修复方式主要是应用自体的皮瓣移植、游离脂肪移植和异体材料填充等,但这些方法均存在弊端。利用种子细胞和支架材料所构建的组织工程脂肪,被认为更适用于软组织的修复重建。细胞外基质(Extracellular matrix ECM)是由组织细胞分泌到细胞外间隙中的大分子物质,在细胞间起连接支持的作用,并能调节细胞的各类生理活动。目前已能从多种组织中分离提取出不同的细胞外基质,如猪小肠黏膜下层和脱细胞真皮,其衍生的生物制品已被应用于临床。但这些生物制品大多取自动物或人的尸体,难以避免病原体传播及免疫排斥反应的发生。脂肪组织作为一种疏松的结缔组织,除含有多种的细胞成分外,还富含大量细胞外基质,这些细胞外基质在维持脂肪组织的结构和功能上发挥重要的作用。脂肪组织可以通过吸脂手术的方式从人体获取,吸脂手术是当前应用最为广泛的整形外科手术之一,对患者造成的创伤小,恢复快,易于被接受。支架材料是组织工程技术的核心和关键,为细胞生长和组织再生提供空间构架,同时还参与种子细胞的黏附、增殖、迁移及新生血管的形成。已有研究者将不同组织来源的细胞外基质构建成具有三维立体形态的生物活性支架,但这些支架多需要外科手术的方式将其植入体内,无法避免植入时的创伤。软组织缺损的形态多不规则,可注射的水凝胶支架形态更适用于软组织缺损的修复。本实验将吸脂手术获取人体脂肪,通过物理,化学及酶制剂相结合的脱细胞方法,获取到脱细胞的脂肪组织(Decellularized adipose tissue DAT),并将其构建成可注射的水凝胶支架。对脂肪脱细胞水凝胶支架的成分,理化性质及体内外生物相容性等进行检测,探讨其用于脂肪组织工程支架的可行性,从而为软组织缺损的修复重建提供新的解决方案。研究方法:1、采用物理,化学和酶学相结合的脱细胞方法,为吸脂手术获取到的人体脂肪组织脱细胞,对提取到的脱细胞脂肪组织分别进行HE染色,DAPI染色、油红O染色及DNA定量检测,评估其脱细胞的有效性;进行胶原纤维、网状纤维、弹力纤维的特异性染色及I型、IV型胶原蛋白,层连蛋白,纤连蛋白的免疫组织化学染色,及胶原蛋白和糖胺聚糖(glycosaminoglycans GAG)的定量测定,评估DAT中ECM不同成分的保留情况。2、利用胶原酶消化法,分离出人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells ADSCs),进行传代培养,测定细胞增殖的情况,绘制生长曲线,进行成脂成骨定向诱导分化。3、将提取的脱细胞脂肪组织,经冻干后研磨成粉,在HCl和胃蛋白酶混合溶液作用下溶解,经体外调节pH值中性后,制备出DAT水凝胶支架。对水凝胶的超微结构,可注射性及体外的凝胶化过程进行观察,同时制备鼠尾腱I型胶原水凝胶支架与其进行对比,进行凝胶浊度动力学检测和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,并观察DAT水凝胶植入大鼠体内后的凝胶化过程。4、将第3代ADCSs在体外接种到DAT水凝胶支架,观察细胞在支架表面的活性及增殖情况,并对复合支架的ADCSs进行成脂诱导,观察支架对ADCSs成脂能力的影响。再将DAT水凝胶支架注射进大鼠皮下后,不同时间段取材,观察植入的水凝胶支架在体内的大体形态变化,将组织切片进行HE染色,masson染色及CD45、CD68的免疫组织化学染色。结果:1、DAT的提取及鉴定:吸脂手术获取的人体脂肪组织,经一系列脱细胞方法处理后,提取出的脱细胞脂肪组织,外观呈不透明的乳白色,质地柔软,无固定形态;HE及DAPI染色无可见细胞核,残留的DNA含量极其微少;组织学染色可见胶原纤维,网状纤维,弹力纤维的存在,免疫组化染色结果显示DAT中的I、IV型胶原蛋白,层连蛋白,纤连蛋白均得以保留;胶原蛋白和GAG定量检测提示这两种成分均存在于脱细胞的组织中,但含量略有减少。2、ADSCs的分离培养鉴定:利用胶原酶消化法分离出ADSCs,通过贴壁生长去除未黏附细胞,ADSCs的生长曲线呈S型,细胞具有自我更新能力,传到第10代仍保持良好的增殖状态。细胞在一定条件下,能定向诱导成脂肪细胞和成骨细胞。3、DAT水凝胶支架的构建及性能检测:构建的DAT水凝胶支架在体外4℃时能顺利通过18G针头,在体内外37℃条件下,能自主聚合形成凝胶。形成的凝胶具有多孔三维结构,含有包括I型胶原蛋白在内的多种肽类成分,凝胶的特性随浓度不同而不同,高浓度的凝胶具有更牢固的外形,开始形成凝胶的时间更早,成胶的速率也更快。4、DAT水凝胶支架体内外生物相容性检测:DAT水凝胶支架,体外复合ADSCs培养对细胞无毒性作用,能促进ADSCs的生长增殖,并能自发诱导ADSCs向脂肪细胞的转化。植入体内后,早期可引起轻微炎症反应,随时间延长,炎症反应逐渐消失,宿主细胞开始向支架内部迁徙,并伴有新生血管和脂肪组织形成。结论:1、采用物理、化学和酶学结合的脱细胞方法,能够从吸脂来源的人体脂肪中提取DAT,提取的DAT中有效去除了脂肪组织中的细胞及脂质成分,保存脂肪ECM中的绝大部分成分。2、DAT能被构建成可注射的水凝胶支架,在体内外一定条件下能自主聚合形成凝胶。形成的凝胶支架具有多孔的三维结构,具有更为复杂的的蛋白成分,凝胶的理化性质随浓度的不同而改变。3、DAT水凝胶支架具有良好的生物相容性,在体外能促进ADSCs的增殖与成脂,植入大鼠体内能促进宿主细胞的迁徙及新生脂肪和血管形成,有望成为脂肪组织工程的理想的支架和软组织缺损的最佳填充材料。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08;R622
【部分图文】：

过程图,脂肪组织,过程,匀浆

3 结果3.1 人脂肪组织脱细胞过程及大体形态观察吸脂抽取物静止分层后收集到的脂肪组织（图 1，A），经高低渗透压液体反复浸泡振荡及多次冻融循环后，可见脂肪颜色变浅，组织疏松，类糜状，表面有大量脂滴漂浮（图 1，B）。冻融后的组织经匀浆离心后，可分为三层，上层为细胞破坏后分离出来的游离脂质，中层为残余的脂肪，底层的白色絮状物为本实验所要提取的脂肪细胞外基质（图 1，C）。多次匀浆离心后，将全部的白色沉淀收集起来，分别加入到 Triton-X100、异丙醇和含有 DNA 酶和 RNA 酶的高渗氯化钠中振荡，再次离心后，最终得到一种黏稠的质地柔软的乳白色物质（图 1，D）。经一系列脱细胞过程，最终得到的 DAT 的体积约为原始脂肪体积的 5% ~ 10%，得到的物质呈乳白色，质地柔软易变形，不溶于水，便于器械操作，易被分离，能被导入不同形状的模具中进行进一步处理。

照片,HE染色,胶原纤维,原有结构

图 2 DAT 和组织组织的 HE 染色结果图中 A、C 分别代表 DAT 组（图 A bar=200μm，图 C bar=20μm）；图 B、D 代表脂肪组（图B bar=200μm，图 D bar=20μm）。3.2.2 Masson 染色Masson 染色中胶原纤维被染成蓝色，照片中可以看到，DAT 丧失了脂肪组织的原有结构，见不到任何细胞成分的残留，可以看到大量胶原纤维的存在。这些胶原纤维是构成 DAT 的主要成分，它们彼此交织成有空隙的条索（图 3），维持着 DAT整体的稳定性。

脂肪组织,地衣红,油红,皮下结缔组织

图 3 DAT 和脂肪组织的 masson 染色结果图中 A、C 分别代表 DAT 组（图 A bar=200μm，图 C bar=20μm）；图 B、D 代表脂肪组（图B bar=200μm，图 D bar=20μm）。3.2.3 Gomori 染色，地衣红染色和油红 O 染色Gomori 染色结果显示，DAT 经脱细胞后，仍有少量网状纤维的成分被保留下来（图 4，A）。DAT 的地衣红染色结果可以看到，在 DAT 组织中，也同样保留了弹力纤维的成分（图 4，C、D），这些皮下结缔组织中常见的纤维成分，在经过一系列的脱细胞过程后，均保留下来存在于 DAT 中。通过对残余脂质的油红 O 染色，可以看到，在 DAT 中，已经看不到脂质成分的残留（图 4，E）。

【参考文献】