miR-129-5p通过调控ABCB1影响乳腺癌MCF-7细胞对紫杉醇敏感性的研究

发布时间：2020-09-28 06:47

　　紫杉醇(Taxol)是治疗乳腺癌、卵巢癌及非小细胞肺癌等各种癌症的常用药物之一。自上世纪90年代临床应用以来,Taxol大大延长了肿瘤患者生存周期。但是,在治疗过程中,肿瘤细胞逐渐对其失敏而出现耐药现象已成为多数患者化疗失败的主要原因。同样,在乳腺癌治疗过程中,乳腺癌细胞对Taxol耐药的矛盾也日益突出,如何逆转癌细胞对Taxol等肿瘤药物的耐药已经成为临床用药的重要问题。多药耐药相关基因ABCB1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1,ABCB1)属于ABC转运蛋白家族中最重要的转运蛋白成员,经糖基化后可编码分子量为170KDa的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),ABCB1的分子结构中具有的6个跨膜区可作为物质跨膜转运通道;而其中的1个ATP结合位点可利用水解ATP释放的能量将生物碱类、蒽环类及紫杉类等化疗药物从肿瘤细胞内逆浓度方向泵出,从而减弱药物的细胞毒性作用。目前已证实ABCB1高表达引起的多药耐药(multi-drug resistance,MDR)是恶性肿瘤化疗的一个重要瓶颈。MDR是指肿瘤细胞在长期接触单一化疗药物的同时,会对结构、功能及杀伤机制迥异的多种化疗药物产生耐药性。多项实验研究表明,与亲本细胞株相比,微小RNAs(MicroRNAs,mi RNAs)在相应肿瘤耐药细胞株中的表达水平有明显差异,说明miRNAs可能与肿瘤细胞耐药性的形成密切相关,调控其表达水平有可能逆转肿瘤耐药,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。已有研究表明:多种miRNAs通过影调控ABC转运蛋白家族成员的表达影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。miR-129-5p是miR-129家族中miR-129-1和miR-129-2的共同转录产物,且为功能的主要体现者。miR-129-5p在乳腺癌细胞中低表达,属于肿瘤抑制性miRNA,与乳腺癌的发生发展、病理分级、临床分期、耐药性及预后密切相关。本实验组通过生物信息网站(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测ABCB1为miR-129-5p的靶基因之一,并且有资料显示,过表达miR-129-5p可通过靶向下调ABCB1提高胃癌细胞对长春新碱和阿霉素的药物敏感性,但对于miR-129-5p在逆转乳腺肿瘤耐药中的作用,尤其是mi R-129-5p对耐药相关蛋白的调控作用尚待进一步研究。目的本研究通过观察miR-129-5p对Taxol作用下乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的影响以及ABCB1、Bcl-2和Bax表达水平的变化,探讨miR-129-5p能否通过调控ABCB1的表达影响乳腺癌MCF-7细胞对Taxol的敏感性,以期为阐明复杂的化疗耐药机制、筛选更有效的抗癌策略与治疗靶点提供新的方向和实验依据。材料和方法1研究对象本研究选用人乳腺癌MCF-7细胞系(购自美国ATCC细胞库),使用RPMI1640完全培养基将其培养于37℃、5%CO_2的细胞培养箱中。2方法2.1实验分组:本实验根据实验目的不同,进行了以下2种分组。(1)筛选药物作用浓度和时间:分为无药物组和不同浓度Taxol(1.95nM、3.9nM、7.81nM、15.63nM、31.25nM、62.5nM、250nM和1000nM)刺激培养组,作用时间分别为24h、48h和72h。(2)过表达miR-129-5p后Taxol对MCF-7细胞的作用:分为空白对照组、转染试剂组、miR-NC组(转染阴性对照)、miR-NC+Taxol组、miR-129-5p mimics组和miR-129-5p mimics+Taxol组。2.2细胞转染:待细胞生长密度达到70%~80%时,利用脂质体转染技术将miR-129-5p mimics及其阴性对照物(miR-NC)转染入MCF-7细胞中。2.3 CCK-8:采用CCK-8方法检测miR-129-5p mimics转染前后Taxol对MCF-7细胞增殖抑制率的影响。2.4流式细胞术:采用流式细胞术检测miR-129-5p mimics转染前后Taxol对MCF-7细胞总凋亡率的影响。2.5细胞荧光染色:采用吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色技术观察miR-129-5p mimics转染前后Taxol对MCF-7细胞凋亡的影响。2.6 qRT-PCR:采用qRT-PCR检测miR-129-5p mimics转染前后Taxol对MCF-7细胞中miR-129-5p和ABCB1、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量的影响。2.7 Western Blot:采用Western Blot检测miR-129-5p mimics转染前后Taxol对MCF-7细胞中ABCB1、Bcl-2和Bax蛋白相对表达量的影响。3统计学处理本研究所得数据均以?x±s表示,用SPSS23.0软件进行统计学分析,两组间细胞生长抑制率比较时采用独立样本t检验或者校正t检验,多组间细胞凋亡、目的基因的mRNA和蛋白水平比较时,采用单因素方差(One Way ANOVA)分析,两两比较采用LSD-t检验。以α=0.05作为检验水准。结果1 Taxol对MCF-7细胞作用浓度和作用时间的筛选MCF-7细胞在不同浓度Taxol作用下,根据其在24h、48h和72h增殖抑制率确定本研究后续实验中Taxol的作用浓度为7.81nM(介于IC_(25)~IC_(30)),培养时间为48 h。2过表达miR-129-5p后Taxol对MCF-7细胞增殖的影响CCK8检测结果显示:与miR-NC+Taxol组比较,miR-129-5p mimics+Taxol组MCF-7细胞的增殖抑制率明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)。3过表达miR-129-5p后Taxol对MCF-7细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示:与mi R-NC+Taxol组比较,miR-129-5p mimics+Taxol组细胞凋亡率增加,差异具有统计学意义(P0.05)。细胞荧光染色结果显示:miR-129-5p mimics+Taxol组中的细胞核染色质多数着橘红色并呈固缩状或圆珠状;miR-NC+Taxol组中的细胞核染色质多着绿色呈固缩状或破碎状,少数细胞核染色质着橘红色。4过表达miR-129-5p后Taxol对MCF-7细胞中ABCB1mRNA及其蛋白相对表达量的影响qRT-PCR和Western Blot检测结果显示:与miR-NC+Taxol组比较,miR-129-5p mimics+Taxol组MCF-7细胞中ABCB1 mRNA及其蛋白的相对表达量降低,差异具有统计学意义(P0.05)。5过表达miR-129-5p后对Taxol对MCF-7细胞中Bcl-2、Bax mRNA及其蛋白相对表达量的影响qRT-PCR和Western Blot检测结果显示:与miR-NC+Taxol组比较,miR-129-5p mimics+Taxol组MCF-7细胞中Bcl-2 mRNA及其蛋白的相对表达量降低;而Bax mRNA及其蛋白的相对表达量增加,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论mi R-129-5p可以通过抑制ABCB1的表达,提高乳腺癌MCF-7细胞对Taxol敏感性。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

MCF-7细胞,作用时间,细胞的

图 3.1 不同浓度的 Taxol 与作用时间对 MCF-7 细胞的生长抑制率表 3.2 不同作用时间下 Taxol 的 IC 值（h） IC25IC30IC5024 12.13±0.36 16.61±0.52 47.61±2.8348 6.65±0.33 8.94±0.38 24.29±0.7472 2.64±0.28 3.51±0.33 9.45±0.40

作用时间,细胞的

图 3.1 不同浓度的 Taxol 与作用时间对 MCF-7 细胞的生长抑制率表 3.2 不同作用时间下 Taxol 的 IC 值间（h） IC25IC30IC5024 12.13±0.36 16.61±0.52 47.61±2.8348 6.65±0.33 8.94±0.38 24.29±0.7472 2.64±0.28 3.51±0.33 9.45±0.40

统计学意义,转染效率,转染

-129-5p mimics 转染效率染 miR-129-5p mimics 后， miR-129-5p mimics 中 miR-1140.67±0.13）高于 miR-NC 组（1.01±0.06）140 倍，差异0.05），而 miR-NC 组与空白对照组、转染试剂组之间无统表 3.3，图 3.3。说明 miR-129-5p 可以有效转染入 MCF-7表 3.3 miR-129-5p 的相对表达量（ x±s）组别 miR-129-5p空白对照组 1.00±0.07转染试剂组 0.93±0.03miR-NC 组 1.01±0.06miR-129-5pmimics 组 140.67±0.13*F 21.6×105P <0.001示与 miR-NC 组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。

【参考文献】