线粒体大麻素受体1在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响

发布时间：2020-10-01 06:23

　　 目的探讨线粒体CB1受体(mitochondrial cannabinoid type 1 receptor,mtCB1R)在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响并初步探讨这一保护作用的具体分子学机制。方法原代培养出生24h之内的Wistar大鼠海马神经元,培养至第8天时采用随机数字表法分为6组。(1)正常组(N组):正常培养,不做任何处理;(2)缺血/再灌注组(I/R组):海马神经元缺血缺氧6h后,恢复血氧供应继续培养20h,构建缺血/再灌注模型;(3)ACEA+缺血/再灌注组(ACEA+I/R组):缺血缺氧6h后立即加入ACEA,终浓度为1μmol/L,恢复血氧供应继续培养20h;(4)ACEA+AM251+缺血/再灌注组(ACEA+AM251+I/R组):氧糖剥夺6h结束后立即加入ACEA和AM251,使其终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,恢复至原培养状态继续培养20h,以此模拟脑缺血/再灌注损伤;(5)ACEA+Hemopressin+缺血/再灌注组(ACEA+Hemo+I/R组):氧糖剥夺6h结束后,同样于恢复血氧供应20h时加入ACEA和Hemopressin,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L;(6)赋形剂组(V+I/R组):于缺血缺氧6h结束后立即加入二甲基亚砜(DMSO),终浓度0.1%,恢复血氧供应继续培养20h。为了确定受体激动剂和抑制剂作用的时间段,将(3)、(4)、(5)、(6)组分别划分为三个亚组,分别于缺血6h给药、再灌注20h给药、缺血/再灌注全程给药,使用CCK-8试剂盒分别测定三个亚组海马神经元的活性;使用倒置显微镜观察各组海马神经元的形态;激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca~(2+)的浓度、ROS的含量;透射电镜观察线粒体超微结构;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、线粒体动力相关蛋白(dynamin-related protein,Drp1)、分裂蛋白1(Fission 1protein,Fis1),细胞凋亡相关蛋白细胞色素C(apoptosis related protein cytochrome c,Cytc)和Rho相关的卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase1,ROCK1)的表达。结果1.在ACEA+I/R组、ACEA+Hemo+I/R组中,与缺血亚组和缺血/再灌注亚组相比,再灌注亚组海马神经元的活性明显增加(P0.05);在ACEA+AM251+I/R组和V+I/R组中,三个亚组之间神经元活性的差异没有明显的统计学意义(P0.05);2.与N组相比,I/R组、ACEA+I/R组、ACEA+AM251+I/R组、ACEA+Hemo+I/R组和V+I/R组的细胞内Ca~(2+)浓度、ROS的含量、细胞凋亡率、以及AIF、Drp1、Fis1、Cytc、ROCK1蛋白的表达水平均明显增加(P0.05);3.与I/R组相比,ACEA+I/R组、ACEA+Hemo+I/R组上述各检测指标明显降低(P0.05),ACEA+AM251+I/R组、V+I/R组上述各检测指标差异无统计学意义(P0.05);4.与ACEA+Hemo+I/R组相比,ACEA+AM251+I/R组上述各指标明显增加(P0.05);5.线粒体超微结构方面,N组线粒体结构完整,线粒体外膜平整光滑,可看到清晰的线粒体嵴;I/R组、ACEA+AM251+I/R组和V+I/R组线粒体肿胀、空泡化、线粒体嵴遭到破坏,线粒体外膜模糊不清;与I/R组相比,ACEA+I/R组、ACEA+Hemo+I/R组线粒体的损害程度均明显降低,仅有少量空泡化,虽不具备典型的线粒体结构,但线粒体嵴和线粒体外膜仍依稀可见。结论线粒体CB1受体可通过降低细胞内ROS的含量来减少细胞内Ca~(2+)浓度和ROCK1的表达,阻断线粒体分裂的启动,并最终减轻海马神经元缺氧复氧损伤。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R614
【文章目录】：
摘要
abstract
引言
第一章 材料与方法
    1.1 实验材料
        1.1.1 实验动物
        1.1.2 实验材料与试剂
        1.1.3 主要仪器与设备
    1.2 实验方法
        1.2.1 原代海马神经元的培养
        1.2.2 氧糖剥夺模型的建立
        1.2.3 实验分组
        1.2.4 CCK-8检测细胞的活性
        1.2.5 细胞内钙离子浓度的测定
        1.2.6 测定细胞内活性氧的含量
        1.2.7 流式细胞仪测定细胞凋亡率
        1.2.8 观察线粒体超微结构
        1.2.9 Westernblot检测线粒体分裂和细胞凋亡相关蛋白的表达
        1.2.10 统计学分析
第二章 实验结果
    2.1 海马神经元的活性
    2.2 海马神经元生长形态的观察
    2.3 细胞内钙离子的浓度
    2.4 .细胞内ROS的含量
    2.5 流式细胞仪测定细胞的凋亡率
    2.6 透射电镜观察线粒体的超微结构
    2.7 线粒体分裂及细胞凋亡相关蛋白的表达
第三章 讨论
第四章 结论
参考文献
综述
    综述参考文献
攻读学位期间的研究成果
致谢

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本文编号：2831512