SHH基因转染激活态雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究

发布时间：2020-10-02 08:43

　　【目的】脊髓损伤临床修复面临难题,再髓鞘化是修复的主要瓶颈之一,本课题通过脂质体介导音猥因子(Sonic Hedgehog,SHH)基因转染大鼠激活态雪旺细胞,过表达音猥因子并增强激活态雪旺细胞增殖和表达神经营养因子的活性,将其移植于损伤局部,探讨音猥因子和激活态雪旺细胞修复脊髓损伤的有效性,并分析两者促进损伤后轴突髓鞘化的协同作用及其机制。【方法】体外研究1.激活态雪旺细胞的分离培养、鉴定和基因转染:选择出生4-6天SD(Sprague Dawley)大鼠,预结扎坐骨神经激活雪旺细胞(Schwann Cells,SCs),1周后切取损伤神经,分离培养、纯化SCs,S100免疫荧光鉴定,保证纯度95%,未预结扎坐骨神经分离获得未激活SCs作为对照。pEGFP-N1-SHH表达质粒已经构建并进行验证,脂质体介导pEGFP-N1-SHH和空载质粒pEGFP-N1转染激活态雪旺细胞(Activated Schwann Cells,ASCs),流式细胞分选绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)表达阳性细胞。2.细胞活性检测:流式分选后对数生长期细胞5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)染色观察细胞增殖情况,转染后不同时期酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测SHH因子及脑源性神经营养因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)的表达情况。Ⅰ组为未激活SCs组,Ⅱ组为未转染的ASCs组,Ⅲ组为转染空载质粒的ASCs(Vector-ASCs,V-ASCs)组,Ⅳ组为转染SHH基因的ASCs(SHH-ASCs,S-ASCs)组。体内研究1.大鼠脊髓损伤模型制备及分组:8-10周龄雌性SD大鼠,共计216只,IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)打击系统制作胸10(Thoracic 10,T10)节段脊髓打击模型,A组为DMEM移植组,B组为ASCs移植组,C组为S-ASCs移植组。2.细胞移植和行为学评价:SCI后1周损伤局部细胞移植。SCI后和移植后当天,SCI后每2周到第12周,每组8只,进行BBB评分(Basso,BeattieBresnahan locomotor rating scale)对各组大鼠后肢功能恢复情况进行评估。3.SCI后局部SHH因子表达:SCI后第2、4、8、12周,每组8只,SCI中心5mm节段,组织蛋白抽提试剂(Tissue Protein Extraction Reagent,T-PER)联合超声裂解提取总蛋白,二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法总蛋白定量,ELISA法测定SHH因子表达水平。4.SCI后局部轴突改变:SCI后第12周,每组8只,SCI中心行神经丝蛋白200(Neurofilament Protein 200,NF200)免疫荧光染色,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核染,轴突计数,观察脊髓损伤局部轴突改变情况。5.损伤局部神经细胞增生及分化:SCI后第2、12周,每组8只,SCI中心分别行巢蛋白(Nestin)、少突胶质细胞转录因子-2(Oligodendrocyte transcription factor-2,Olig2)(增加损伤中心周围白质)、胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)免疫荧光染色,DAPI核染,细胞计数,观察脊髓损伤局部神经细胞增殖和分化。6.损伤局部白质及髓鞘变化:SCI后第4、12周,每组8只,SCI中心快蓝(Luxol fast blue,LFB)髓鞘染色,计算白质面积比例、髓鞘面积比例,观察脊髓损伤局部白质、髓鞘变化。7.数据统计分析:数据收集、统计采用SPSS 20.0软件完成,数据均使用`X±S表示。多组均数之间采用单因素方差分析法进行显著性检验,并利用LSD法进行多组均数之间的两两显著性检验;两组均数之间比较应用t检验。以P0.05为差异具有统计学意义。【结果】体外研究1.细胞增殖观察:EdU染色发现Ⅳ组(S-ASCs,26.17±4.03%)染色阳性率最高,Ⅱ组(ASCs,20.41±3.16%)和Ⅲ组(V-ASCs,19.34±2.82%)其次,Ⅰ组(SCs,11.86±2.98%)最低,具有统计学意义(P0.05)。2.SHH、BDNF和NGF的表达:Ⅰ组和Ⅱ组经传代、Ⅲ组和Ⅳ组经流式分选后培养1、2、4、6、8周,不同时期SHH、BDNF和NGF的表达,Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组均高于Ⅰ组,其中Ⅳ组表达水平最高,具有统计学意义(P0.05)。体内研究1.行为学评价:SCI后第2周到第12周各组大鼠后肢功能都有恢复,SCI后第12周实验结束时,C组(16.13±2.03分)最高,B组(13.50±1.77分)其次,A组(9.25±1.58分)最低,具有统计学意义(P0.01)。2.SCI后局部SHH因子的表达:SCI后第2、4周,C组表达水平最高,B组其次,A组最低,具有统计学意义(P0.01),第8、12周,3组表达水平比较无统计学意义(P?0.05),基本接近正常大鼠脊髓表达水平。3.SCI后局部轴突改变:SCI后第12周,SCI中心轴突(NF200阳性)计数C组(55.13±12.16根/视野)最多,B组(23.63±8.75根/视野)其次,A组(10.50±5.58根/视野)最少,具有统计学意义(P0.01)。4.SCI后局部神经细胞增生及分化:SCI后第2、12周,SCI中心神经干细胞(Nestin~+细胞)、损伤中心和周围白质少突胶质细胞前体细胞(Olig2~+细胞)计数C组最多,B组其次,A组最少,具有统计学意义(P0.05),各组内比较,随时间延长无统计学意义(P?0.05);SCI后第2周,SCI中心星形胶质细胞(GFAP~+细胞)计数B组和C组多于A组,具有统计学意义(P0.01),至第12周C组最少,具有统计学意义(P0.01)。5.SCI后局部白质及髓鞘变化:SCI后第4到第12周,各组大鼠白质面积比例基本稳定无改变,无统计学意义(P?0.05),白质髓鞘面积比例B组和C组明显增加,具有统计学意义(P?0.05);两个时间,白质面积、髓鞘面积比例C组最大,B组其次,A组最小,具有统计学意义(P0.05)。【结论】1.脂质体介导SHH表达质粒转染激活态雪旺细胞可过表达SHH因子,强化激活ASCs,促进细胞增殖,并促进BDNF和NGF的表达,且可维持至转染后6周以上。2.亚急性期脊髓损伤局部移植SHH基因转染强化激活的ASCs,比较单纯ASCs和DMEM,可以更好的促进大鼠损伤局部轴突髓鞘化、保护轴突,获得后肢功能的恢复,确定联合SHH因子和ASCs移植修复SCI的有效性。3.SHH因子可强化激活ASCs且转染细胞可成功表达SHH因子,两者联合既提供外源性移植细胞,又激活内源性神经细胞,增加神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞,协同促进轴突髓鞘化,保护轴突,进一步支持髓鞘化和功能恢复的相关性。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R651.2
【部分图文】：

附录,形态,细胞,极细胞

的形态呈现长梭形，2 极居多，也有部分细胞表现为 3 极，极少有ASCs、V-ASCs 和 S-ASCs 3 组和 SCs 组在外形上无明显差异，也多，但在相同视野下，3 极细胞比未激活 SCs 多，部分区域可见到的细胞，每代始终形态上相近。方式上，随着培养时间的延长，达到一定密度后，SCs 停止增殖，力不佳，而 ASCs、V-ASCs 和 S-ASCs 3 组在相同密度下，仍能继形态保持不变，但是 ASCs 和 V-ASCs 经历 8 代后、S-ASCs 经历胞形态和生长方式上同原代 SCs 基本相同。染色鉴定 SCs 和 ASCs，纯度达到 95% 以上（附录 3）。U 染色观察细胞增殖活性生长期细胞 EdU 染色观察细胞增殖活性，发现Ⅳ组（S-ASCs）染（26.17±4.03%），Ⅱ组（ASCs）和Ⅲ组（V-ASCs）其次（20.41±32%，无统计学意义），Ⅰ组（SCs，11.86±2.98%）最低，具有统计.05）（图 1、附录 4）。

培养细胞,单位

表 1 培养细胞 SHH 表达（单位：ng/ml）时间（周）Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 Ⅳ组 F1 0.16±0.11 0.47±0.0710.46±0.1011.77±0.09 463.177*2 0.20±0.09 0.58±0.0810.52±0.0811.36±0.08 289.174*4 0.17±0.05 0.61±0.0910.58±0.0911.16±0.09 203.879*6 0.11±0.10 0.70±0.09 0.58±0.07 0.88±0.12 95.736**8 0.11±0.10 0.67±0.1310.61±0.0810.68±0.08160.226***P<0.01；1比较无统计学意义（P 0.05）

培养细胞,单位

表 2 培养细胞 BDNF 表达（单位：ng/ml）时间周）Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 Ⅳ组 F1 0.29±0.1610.54±0.1620.42±0.181,22.92±0.18 447.737*2 0.39±0.13 0.82±0.22 0.62±0.12 2.36±0.24 183.532*4 0.35±0.15 1.06±0.1711.04±0.2412.25±0.18 139.209*6 0.30±0.10 1.43±0.17 1.27±0.09 1.77±0.15 180.941*8 0.26±0.06 1.60±0.251,21.41±0.2111.73±0.192100.461*P<0.01；1,2比较无统计学意义

【参考文献】